LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích Clenbuterol trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi lợn
MỞ ðẦU .......................................................................................................................1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................................4 1.1. Một số thông tin chung về Clenbuterol ................................................. 4
1.1.1. Cơ chế tác dụng của β-agonist.........................................................................5
1.1.2. Dược ñộng học của β-agonists ........................................................................6
1.1.3. Phân loại ...........................................................................................................7
1.2. Thông tin liên quan ñến việc sử dụng Clenbuterol trong chăn nuôi....... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.......................................... 15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ..............................................................15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước...............................................................16
1.4. Các phương pháp phân tích kiểm tra các chất kích thích sinh
trưởng trong thức ăn và sản phẩm chăn nuôi....................................... 17
1.4.1. Phương pháp sàng lọc (Screening Test)........................................................17
1.4.2. Phương pháp khẳng ñịnh và ñịnh luợng chính xác.......................................19
1.5. Các qui ñịnh liên quan ñến các chất kích thích sinh trưởng trong
chăn nuôi ............................................................................................ 21 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................24 2.1. ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu ...................................... 24
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu ....................................................................................24
2.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu ......................................................................................24
2.1.3. Thời gian nghiên cứu .....................................................................................24
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii
2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị ................................................... 24 2.3 Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 25
2.3.1. Một số ñặc ñiểm về hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn và thuốc thú y
tại một số tỉnh vùng ðồng bằng sông Hồng .................................................25
2.3.2. Nghiên cứu ñánh ñánh giá khả năng phân tích phát hiện Clenbuterol
trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA ...................25
2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 25
2.4.1. Phương pháp ñiều tra .....................................................................................26
2.4.2. Phương pháp tách chiết mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt........................27
2.4.3. Phương pháp ñánh giá các tham số của phương pháp..................................29
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................30
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................31 3.1. Một số ñặc ñiểm về hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi và
thuốc thú y dùng trong chăn nuôi lợn tại một số tỉnh trên ñịa bàn
ðồng bằng sông Hồng ........................................................................ 31
3.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi.....................................................31
3.1.2. Hoạt ñộng kinh doanh thuốc thú y ................................................................34
3.1.3. Quản lý nhà nước về thức ăn chăn nuôi, hóa chất và thuốc thú y................38
3.2. ðánh giá khả năng phân tích Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi
và thịt lợn bằng phương pháp ELISA.................................................. 39
3.2.1. Thăm dò tính ổn ñịnh của phương pháp thông qua thử nghiệm xây
dựng ñường chuẩn .........................................................................................39
3.2.2. Thăm dò ngưỡng phát hiện của kít ELISA ...................................................42
3.2.3. Kết quả xác ñịnh khả năng phát hiện (CCβ)..................................................44
3.2.4. Kết quả xác ñịnh ñộ ñặc hiệu, ñộ chọn lọc và ñộ xác thực của phương
pháp ................................................................................................................47
3.2.5. Thử nghiệm phân tích các mẫu củng cố và mẫu thực ñã khẳng ñịnh
bằng phương pháp sắc ký ở các nồng ñộ khác nhau ....................................49
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv
4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ....................................................................................52 4.1. Kết luận .............................................................................................. 52
4.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y tại tỉnh thuộc
ñịa bàn Vùng ðồng bằng sông Hồng ............................................................52
4.1.2. Khả năng phát hiện Clenbuterol của phương pháp ELISA..........................52
4.2. ðề nghị ............................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................54
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số ñặc ñiểm cấu tạo và tính chất lý hóa của Clenbuterol và salbutamol .......................................................................................................... 5 Bảng 1.2. Kết quả kiểm tra giám sát sử dụng kháng sinh và chất cấm năm 2014 ...... 14
Bảng 1.3. Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) của phòng thí nghiệm
tham chiếu của ðức ......................................................................................... 21 Bảng 1.4. Quy ñịnh mẫu dương tính theo phương pháp ñịnh lượng ........................... 23 Bảng 2.1. Dung lượng mẫu ñiều tra .............................................................................. 27 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm xác ñịnh các tham số của phương pháp........................... 30
Bảng 3.1. Kết quả ñánh giá ñiều kiện kinh doanh của các ñại lý và cửa hàng
thuốc thú y........................................................................................................ 36 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra tính ổn ñịnh của ñường chuẩn .......................................... 40
Bảng 3.3. Kết quả thử tính ổn ñịnh của phương pháp thông qua việc xây dựng ñường chuẩn..................................................................................................... 42 Bảng 3.4. Kết quả xác ñịnh giới hạn phát hiện của phương pháp................................ 43
Bảng 3.5. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố ñể xác ñịnh khả năng
phát hiện (CCβ) của phương pháp ................................................................... 45
Bảng 3.6. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố clenbuterol ở nồng ñộ 1
ppb ñối với nền mẫu là thức ăn chăn nuôi lợn ................................................ 48
Bảng 3.7. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố clenbuterol ở nồng ñộ 1
ppb ñối với nền mẫu là thịt lợn........................................................................ 48
Bảng 3.8. Kết quả ñánh giá các tham số của phương pháp trên các nên mẫu
khác nhau (%) .................................................................................................. 49
Bảng 3.9. Kết quả thử nghiệm phân tích các mẫu củng cố ở các nồng ñộ khác
nhau .................................................................................................................. 50 Bảng 3.10. Kết quả thử nghiệm phân tích các mẫu thực ở các nồng ñộ khác nhau ...... 51
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi
DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH
Hình 1.2. Bao chất tạo nạc Super Weight 02 ñược phát hiện tại ðồng Nai ngày 10/3/2011.......................................................................................................... 12 Sơ ñồ 3.1. Mạng lưới phân phối thức ăn chăn nuôi...................................................... 32 Hình 3.1. Sản phẩm không có nhãn mác và hướng dẫn sử dụng................................. 34 Sơ ñồ 3.2. Mạng lưới phân phối thuốc thuốc thú y ...................................................... 35
Hình 3.2. ðường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng ñộ clenbuterol và ñộ
hấp phụ ............................................................................................................. 41
Hình 3.3. Kết quả xác ñịnh ñường Cut-off và giá trị CCβ của phương pháp khi
phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi ................................................ 46
Hình 3.4. Kết quả xác ñịnh ñường Cut-off và giá trị CCβ của phương pháp khi
phân tích clenbuterol trong thịt lợn ................................................................. 47
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii
Từ viết tắt CCβ
cs
ELISA ESI
FAO FDA FSIS
HPLC HPTLC KHKTNN LC/MS/MS
LOD NN&PTNT ppb
TĂCN UPLC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Diễn giải
Khả năng phát hiện
Cộng sự
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Bộ nguồn ion hóa phun ñiện tử
Food Agricultural Organization
Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ
Cơ quan thanh tra và quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Khoa học kỹ thuật nông nghiệp
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography/Mass Spectrometer)
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
Phần tỷ (Parts per billion)
Thức ăn chăn nuôi
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii
MỞ ðẦU
Clenbuterol là một chất thuộc nhóm Beta – Agonist có tác dụng dược lý hiệu quả khi sử dụng bằng ñường miệng, khi vào cơ thể ñộng vật sẽ ảnh hưởng tới mô cơ, kích thích tổng hợp protein, tích lũy nạc, giảm sinh tổng hợp và giảm tích mỡ. Chính vì những tác dụng ñặc thù này nên nó ñã ñược sử dụng trong chăn nuôi nhằm mục ñích kích thích sinh trưởng và tăng tỷ lệ nạc.
Tuy nhiên, những phát hiện từ các nghiên cứu ñộc chất học cho thấy chất này có tác dụng giãn phế quản, giãn cơ trơn cuống phổi, run cơ, rối loạn nhịp tim, gây choáng váng và nếu sử dụng kéo dài có thể gây ung thư. ðặc biệt, khi sử dụng các hợp chất này trong chăn nuôi rất dễ gây tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi, ảnh hưởng không tốt ñến sức khỏe người tiêu dùng. Theo công bố của một nghiên cứu ở Anh, Clenbuterol là chất bền với nhiệt, hầu như không bị biến ñổi, mất ñi trong khi nấu ở nhiệt ñộ sôi, chỉ bị phá hủy ở 2600C trong khoảng 5 phút. Chính vì thế, năm 1996 Ủy ban Châu Âu ñã chính thức cấm sử dụng Clenbuterol trong chăn nuôi tại các nước thành viên (EU, 1996).
Ở Việt Nam, vào ngày 20/06/2002 Bộ NN & PTNT ñã ban hành quyết ñịnh số 54/2002/Qð – BNN nay vừa ñược thay thế bằng Thông tư 28/2014/TT- BNNPTNT ban hành ngày 04/09/2014 về việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng 22 loại kháng sinh, hóa chất trong sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi trong ñó có các chất thuộc nhóm Beta-Agonist. Tuy nhiên, trong thực tế chăn nuôi vì chạy theo lợi nhuận người chăn nuôi vẫn sử dụng bất hợp pháp Clenbuterol ñể kích thích tăng trọng và tăng tỷ lệ nạc cho gia súc lấy thịt (Bùi Thị Phương Hòa, 2008).
Chính vì vậy, từ khi có qui ñịnh cấm ñến nay, vẫn liên tục có những thông báo về sử dụng bất hợp pháp và tồn dư Clenbuterol trong thịt gây hoang mang dư luận và e sợ cho các nhà quản lý. ðặc biệt, trong chiến dịch tăng cường kiểm tra Clenbuterol do Cục Chăn nuôi tổ chức, Viện KHKTNN Miền Nam
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1
công bố 6,3% số mẫu thịt ñược xét nghiệm chứa Clenbuterol. Trong khi ñó, khi kiểm tra các mẫu nghi ngờ, Chi cục Thú Y TP HCM phát hiện 16% mẫu thịt dương tính với Clenbuterol. Gần ñây, kết quả kiểm tra trong 3 tháng ñầu năm 2012 của Cục Chăn nuôi khi kiểm tra 268 mẫu thức ăn, 179 mẫu thịt, gan lợn và 18 mẫu thuốc thú y nghi ngờ ñể kiểm tra ñã phát hiện 4,8% mẫu thức ăn chăn nuôi, 4,4% mẫu thịt và hơn 11% mẫu thuốc thú y dương tính với beta-agonist (Bộ NN&PTNT, 2012).
Trong quá trình kiểm tra, do năng lực của các phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế, chưa ñạt chuẩn nên gặp nhiều khó khăn, chưa ñáp ứng yêu cầu thực tế, ñặc biệt do phương pháp, qui trình phân tích của các phòng thí nghiệm khác nhau, kết quả phân tích chưa thống nhất và tin cậy nên nhiều công bố ñã gây thiệt hại ñáng kể cho ngành chăn nuôi Việt Nam.
Chính vì vậy, ngày 07/11/2012, Bộ Nông nghiệp và PTNT ñã ban hành Thông tư số 57/2012/BNNPTNT Ban hành Quy ñịnh việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist trong chăn nuôi, một trong các nội dung quan trọng nhất của phương pháp này liên quan ñến qui trình phân tích, phương pháp thử nhanh và ELISA muốn ñược công nhận kết quả phải có giới hạn phát hiện nhỏ hơn 0,2 ppb (Bộ NN&PTNT, 2012). Kể từ ñó nhiều phòng thí nghiệm ñã ñược trang bị hệ thống ELISA, nhiều lớp tập huấn về ký thuật phân tích nhưng việc sử dụng ñể phân tích, ñặc biệt phân tích các chất cấm như Clenbuterol còn rất hạn chế. ðặc biệt yêu cầu qui trình phân tích từ sàng lọc ñến khẳng ñịnh phải có khả năng phát hiện tối thiểu là 0,2 ppb ñã buộc các phòng thí nghiệm phải ñánh giá lại các phương pháp ñang ñược áp dụng, trong ñó có phương pháp EILSA.
Xuất phát từ thực tế ñó việc ñánh giá thực trạng sử dụng thuốc và hóa chất trong chăn nuôi và triển khai ñánh giá các phương pháp có ñộ chính xác, ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu cao như phương pháp hóa miễn dịch enzyme (ELISA) ñể kiểm soát tình trạng tồn dư thuốc thú y nói chung và Clenbuterol nói riêng trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2
thức ăn chăn nuôi theo qui ñịnh mới là hết sức cấp bách. Không chỉ ñảm bảo qui ñịnh trong thông tư 57/2012/BNNPTNT của Bộ NN&PTNT mà còn phục vụ cho sự phát triển chăn nuôi bền vững, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng trong nước. Trước yêu cầu ñó, nghiên cứu tiến hành “ðánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp ELISA ñể phát hiện Clenbuterol có trong thịt và thức ăn chăn nuôi lợn”.
Mục ñích ñề tài:
- ðánh giá tình hình kinh doanh hóa chất và thuốc thú y dùng trong chăn nuôi thú y ở tại một số tỉnh khu vực ñồng bằng sông Hồng.
- ðánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp ELISA ñể phát hiện Clenbuterol có trong thịt và thức ăn chăn nuôi lợn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số thông tin chung về Clenbuterol
β-agonists là nhóm các hormone tự nhiên, có nguồn gốc từ các Catecholamines (Adrenaline, Noradrenaline và Dopamine), có tác dụng làm giãn cơ cuống phổi, giãn cơ tử cung, ñồng thời kích thích giải phóng insulin và quá trình phân giải glucose nên ñược sử dụng ñể ñiều trị bệnh hen suyễn ở người và ñộng vật. Nếu sử dụng kéo dài có tác dụng tăng cường tổng hợp protein, tăng tỷ lệ nạc, giảm tích mỡ. Tuy nhiên, nếu thức ăn có nguồn gốc từ ñộng vật bị nhiễm các chất này có thể gây ra các biến chứng liên quan ñến tim mạch, hệ thần kinh trung ương...
Côngthứcphântử của Clenbuterol làC12H18N2Cl12(IUPAC): 4-amino- 3,5-dichloro-phenyl hay (tert-butylamino) ethanol Mol. weight: 277.19 thường ở dạng tinh thể không màu, bền với nhiệt, có khả năng hòa tan trong nước và một số dung môi hữu cơ như aceton, methanol và ethanol (Bảng 1.1).
Mặc dù beta-agonist ñã ñược phát hiện ñã từ lâu, nhưng ñến năm 1903, beta-agonist ñược tổng hợp lần ñầu tiên và mới ñược công nhận như thuốc. Từ những nghiên cứu phát hiện những tác dụng tích cực của beta-agonist, ñặc biệt là Isoproterenol trong những năm 1940, Isoetharine năm 1951 và Metaproterenol năm 1961 mà các chất thuộc nhóm beta-agonist mới ñược sử dụng trong ñiều trị hen, suyễn ở người và ñộng vật.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4
Bảng 1.1. Một số ñặc ñiểm cấu tạo và tính chất lý hóa của Clenbuterol và salbutamol
1.1.1. Cơ chế tác dụng của β-agonist
Tác dụng chữa bệnh hen suyễn ở người và ñộng vật do nhóm β-agonist có
khả năng làm tăng lượng AMP vòng do ức chế phosphodiesterase làm giãn cơ trơn khí quản. ðồng thời ức chế adenosin tại ñiểm tiếp nhận do adenosin gây co thắt khí quản và tăng phóng thích histamin từ tế bào phổi, làm ổn ñịnh màng tế bào nên giảm tiết các chất trung gian, tăng sự vận chuyển chất nhầy trên ñường hô hấp.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5
ðối với mô cơ: ñể phát huy tác dụng, nhóm β-agonist thường thông qua các ñiểm tiếp nhận β nằm trong các loại tế bào trong cơ thể, bao gồm tế bào thần kinh, ñặc biệt tế bào cơ và tế bào mỡ. Theo Beermann và cs. (1984), β-agonists là tác nhân phân phối mỡ, làm giảm sự tổng hợp và tích lũy mô mỡ trên cơ thể gia súc, gia cầm. Tuy nhiên, ñể ñạt ñược kết quả này, cần sử dụng liều gấp 5-10 lần so với liều ñiều trị thông thường.
Kết quả một số nghiên cứu khác ñã cho biết β - agonists là yếu tố cần thiết trong việc mở ñầu kích thích sự phát triển của cơ (Maltin và cs., 1987). Dưới tác ñộng của β - agonists, khả năng gia tăng protein trong cơ là do sự giảm thoái biến protein và ñồng thời gia tăng tổng hợp protein.
1.1.2. Dược ñộng học của β-agonists
β-agonists hấp thu tốt khi cấp qua ñường uống cho ñộng vật thí nghiệm, người và các loài khác. Ngoài ra, các hợp chất thuộc nhóm này còn có thể hấp thu qua ñường hô hấp, ñặc biệt salbutamol nên ñược ứng dụng ñể ñiều trị hen suyễn trên người. Khi vào cơ thể bằng ñường uống, beta-agonist ñược hấp thu dọc theo ñường tiêu hóa từ dạ dày ñến ruột và một phần tái hấp thu ở thận.
Ở hầu hết các loài ñộng vật, khi thử nghiệm ñều co thấy β-agonists vào cơ thể bằng ñường miệng có thể ñạt nồng ñộ cao nhất trong máu sau 2-4 giờ và phân bố khắp các mô. Thử nghiệm trên chuột, chó, khỉ, bò cho thấy Clenbutrol lưu lại lâu nhất ở gan, thận và một phần clenbuterol và salbutamol không chuyển hóa kịp sẽ ñược tích lũy trong một số mô với nhiều mức ñộ khác nhau như mật, mắt, sau ñó giảm dần theo thời gian khi ngừng sử dụng.
Ở hầu hết các loài ñộng vật, khi thử nghiệm ñều cho thấy clenbutrol ñược bài tiết nhiều nhất qua phân và nước tiểu ở dạng nguyên chất. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong vòng 96 giờ có 74% thuốc ñã ñược bài tiết, 30% trong nước tiểu và 44 % trong phân. Ở gia súc, uống salbutamol với liều 1mg/kg thể trọng thì sau 8 giờ nó bài thải khoảng 40-70% qua nước tiểu. Trong ñó, khoảng 48% liều ở dạng không hoạt tính và 24-33% ở dạng có hoạt tính.
Tại Việt Nam, sau công bố của các phòng thí nghiệm khu vực phía nam thực hiện ñã gây ảnh hưởng rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng vào năm 2010 và năm 2011 Bộ Nông nghiệp & PTNT ñã ban hành thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012) về việc giám sát chất cấm trong chăn nuôi. Theo qui ñịnh của thông tư, khi phân tích mẫu có thể sử dụng một trong hai cách sau:
a. Cách thứ nhất (áp dụng trong trường hợp cần kết quả kiểm tra nhanh): Tiến hành phân tích ñịnh tính bằng kit thử nhanh hay phân tích bán ñịnh lượng bằng kit ELISA chung cho nhóm Beta-agonist hay ñịnh tính riêng cho từng chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine. Giới hạn phát hiện (LOD) của kit thử nhanh và kit ELISA phải nhỏ hơn 0,2 ppb. Nếu kết quả âm tính thì kết thúc quá trình kiểm tra.
Nếu kết quả dương tính phải tiếp tục phân tích ñịnh lượng bằng phương pháp sắc ký ñể khẳng ñịnh mẫu có thực sự dương tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist hay không.
b) Cách thứ hai: dùng phương pháp phân tích ñịnh lượng bằng phương pháp sắc ký ñối với các chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine.
ðặc biệt một ñiểm mới khác cần ghi nhận ở thông tư này ñã qui ñịnh việc xử lý kết quả rất cụ thể và ñảm bảo ñược sự chính xác về thông tin kết quả. Nếu kết quả âm tính bằng các phương pháp phân tích trên thì khẳng ñịnh mẫu không vi phạm (hay mẫu âm tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Kết quả dương tính bằng phân tích ñịnh lượng là cơ sở ñể xử lý vi phạm và công bố mẫu vi phạm (hay mẫu dương tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Căn cứ ñể khẳng ñịnh mẫu dương tính ñược quy ñịnh tại Phụ lục II ban hành kèm theo Thông tư này. Mẫu ñược coi là dương tính khi có kết quả phân tích ñịnh lượng cao hơn hay bằng một trong các giá trị (tính bằng ppb) nêu tại bảng 1.3.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích Clenbuterol trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi lợn
MỞ ðẦU .......................................................................................................................1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................................4 1.1. Một số thông tin chung về Clenbuterol ................................................. 4
1.1.1. Cơ chế tác dụng của β-agonist.........................................................................5
1.1.2. Dược ñộng học của β-agonists ........................................................................6
1.1.3. Phân loại ...........................................................................................................7
1.2. Thông tin liên quan ñến việc sử dụng Clenbuterol trong chăn nuôi....... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.......................................... 15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ..............................................................15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước...............................................................16
1.4. Các phương pháp phân tích kiểm tra các chất kích thích sinh
trưởng trong thức ăn và sản phẩm chăn nuôi....................................... 17
1.4.1. Phương pháp sàng lọc (Screening Test)........................................................17
1.4.2. Phương pháp khẳng ñịnh và ñịnh luợng chính xác.......................................19
1.5. Các qui ñịnh liên quan ñến các chất kích thích sinh trưởng trong
chăn nuôi ............................................................................................ 21 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................24 2.1. ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu ...................................... 24
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu ....................................................................................24
2.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu ......................................................................................24
2.1.3. Thời gian nghiên cứu .....................................................................................24
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii
2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị ................................................... 24 2.3 Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 25
2.3.1. Một số ñặc ñiểm về hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn và thuốc thú y
tại một số tỉnh vùng ðồng bằng sông Hồng .................................................25
2.3.2. Nghiên cứu ñánh ñánh giá khả năng phân tích phát hiện Clenbuterol
trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA ...................25
2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 25
2.4.1. Phương pháp ñiều tra .....................................................................................26
2.4.2. Phương pháp tách chiết mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt........................27
2.4.3. Phương pháp ñánh giá các tham số của phương pháp..................................29
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................30
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................31 3.1. Một số ñặc ñiểm về hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi và
thuốc thú y dùng trong chăn nuôi lợn tại một số tỉnh trên ñịa bàn
ðồng bằng sông Hồng ........................................................................ 31
3.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi.....................................................31
3.1.2. Hoạt ñộng kinh doanh thuốc thú y ................................................................34
3.1.3. Quản lý nhà nước về thức ăn chăn nuôi, hóa chất và thuốc thú y................38
3.2. ðánh giá khả năng phân tích Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi
và thịt lợn bằng phương pháp ELISA.................................................. 39
3.2.1. Thăm dò tính ổn ñịnh của phương pháp thông qua thử nghiệm xây
dựng ñường chuẩn .........................................................................................39
3.2.2. Thăm dò ngưỡng phát hiện của kít ELISA ...................................................42
3.2.3. Kết quả xác ñịnh khả năng phát hiện (CCβ)..................................................44
3.2.4. Kết quả xác ñịnh ñộ ñặc hiệu, ñộ chọn lọc và ñộ xác thực của phương
pháp ................................................................................................................47
3.2.5. Thử nghiệm phân tích các mẫu củng cố và mẫu thực ñã khẳng ñịnh
bằng phương pháp sắc ký ở các nồng ñộ khác nhau ....................................49
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv
4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ....................................................................................52 4.1. Kết luận .............................................................................................. 52
4.1.1. Hoạt ñộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y tại tỉnh thuộc
ñịa bàn Vùng ðồng bằng sông Hồng ............................................................52
4.1.2. Khả năng phát hiện Clenbuterol của phương pháp ELISA..........................52
4.2. ðề nghị ............................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................54
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số ñặc ñiểm cấu tạo và tính chất lý hóa của Clenbuterol và salbutamol .......................................................................................................... 5 Bảng 1.2. Kết quả kiểm tra giám sát sử dụng kháng sinh và chất cấm năm 2014 ...... 14
Bảng 1.3. Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) của phòng thí nghiệm
tham chiếu của ðức ......................................................................................... 21 Bảng 1.4. Quy ñịnh mẫu dương tính theo phương pháp ñịnh lượng ........................... 23 Bảng 2.1. Dung lượng mẫu ñiều tra .............................................................................. 27 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm xác ñịnh các tham số của phương pháp........................... 30
Bảng 3.1. Kết quả ñánh giá ñiều kiện kinh doanh của các ñại lý và cửa hàng
thuốc thú y........................................................................................................ 36 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra tính ổn ñịnh của ñường chuẩn .......................................... 40
Bảng 3.3. Kết quả thử tính ổn ñịnh của phương pháp thông qua việc xây dựng ñường chuẩn..................................................................................................... 42 Bảng 3.4. Kết quả xác ñịnh giới hạn phát hiện của phương pháp................................ 43
Bảng 3.5. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố ñể xác ñịnh khả năng
phát hiện (CCβ) của phương pháp ................................................................... 45
Bảng 3.6. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố clenbuterol ở nồng ñộ 1
ppb ñối với nền mẫu là thức ăn chăn nuôi lợn ................................................ 48
Bảng 3.7. Kết quả phân tích mẫu trắng và mẫu củng cố clenbuterol ở nồng ñộ 1
ppb ñối với nền mẫu là thịt lợn........................................................................ 48
Bảng 3.8. Kết quả ñánh giá các tham số của phương pháp trên các nên mẫu
khác nhau (%) .................................................................................................. 49
Bảng 3.9. Kết quả thử nghiệm phân tích các mẫu củng cố ở các nồng ñộ khác
nhau .................................................................................................................. 50 Bảng 3.10. Kết quả thử nghiệm phân tích các mẫu thực ở các nồng ñộ khác nhau ...... 51
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi
DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH
Hình 1.2. Bao chất tạo nạc Super Weight 02 ñược phát hiện tại ðồng Nai ngày 10/3/2011.......................................................................................................... 12 Sơ ñồ 3.1. Mạng lưới phân phối thức ăn chăn nuôi...................................................... 32 Hình 3.1. Sản phẩm không có nhãn mác và hướng dẫn sử dụng................................. 34 Sơ ñồ 3.2. Mạng lưới phân phối thuốc thuốc thú y ...................................................... 35
Hình 3.2. ðường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng ñộ clenbuterol và ñộ
hấp phụ ............................................................................................................. 41
Hình 3.3. Kết quả xác ñịnh ñường Cut-off và giá trị CCβ của phương pháp khi
phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi ................................................ 46
Hình 3.4. Kết quả xác ñịnh ñường Cut-off và giá trị CCβ của phương pháp khi
phân tích clenbuterol trong thịt lợn ................................................................. 47
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii
Từ viết tắt CCβ
cs
ELISA ESI
FAO FDA FSIS
HPLC HPTLC KHKTNN LC/MS/MS
LOD NN&PTNT ppb
TĂCN UPLC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Diễn giải
Khả năng phát hiện
Cộng sự
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Bộ nguồn ion hóa phun ñiện tử
Food Agricultural Organization
Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ
Cơ quan thanh tra và quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Khoa học kỹ thuật nông nghiệp
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography/Mass Spectrometer)
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
Phần tỷ (Parts per billion)
Thức ăn chăn nuôi
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii
MỞ ðẦU
Clenbuterol là một chất thuộc nhóm Beta – Agonist có tác dụng dược lý hiệu quả khi sử dụng bằng ñường miệng, khi vào cơ thể ñộng vật sẽ ảnh hưởng tới mô cơ, kích thích tổng hợp protein, tích lũy nạc, giảm sinh tổng hợp và giảm tích mỡ. Chính vì những tác dụng ñặc thù này nên nó ñã ñược sử dụng trong chăn nuôi nhằm mục ñích kích thích sinh trưởng và tăng tỷ lệ nạc.
Tuy nhiên, những phát hiện từ các nghiên cứu ñộc chất học cho thấy chất này có tác dụng giãn phế quản, giãn cơ trơn cuống phổi, run cơ, rối loạn nhịp tim, gây choáng váng và nếu sử dụng kéo dài có thể gây ung thư. ðặc biệt, khi sử dụng các hợp chất này trong chăn nuôi rất dễ gây tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi, ảnh hưởng không tốt ñến sức khỏe người tiêu dùng. Theo công bố của một nghiên cứu ở Anh, Clenbuterol là chất bền với nhiệt, hầu như không bị biến ñổi, mất ñi trong khi nấu ở nhiệt ñộ sôi, chỉ bị phá hủy ở 2600C trong khoảng 5 phút. Chính vì thế, năm 1996 Ủy ban Châu Âu ñã chính thức cấm sử dụng Clenbuterol trong chăn nuôi tại các nước thành viên (EU, 1996).
Ở Việt Nam, vào ngày 20/06/2002 Bộ NN & PTNT ñã ban hành quyết ñịnh số 54/2002/Qð – BNN nay vừa ñược thay thế bằng Thông tư 28/2014/TT- BNNPTNT ban hành ngày 04/09/2014 về việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng 22 loại kháng sinh, hóa chất trong sản xuất kinh doanh thức ăn chăn nuôi trong ñó có các chất thuộc nhóm Beta-Agonist. Tuy nhiên, trong thực tế chăn nuôi vì chạy theo lợi nhuận người chăn nuôi vẫn sử dụng bất hợp pháp Clenbuterol ñể kích thích tăng trọng và tăng tỷ lệ nạc cho gia súc lấy thịt (Bùi Thị Phương Hòa, 2008).
Chính vì vậy, từ khi có qui ñịnh cấm ñến nay, vẫn liên tục có những thông báo về sử dụng bất hợp pháp và tồn dư Clenbuterol trong thịt gây hoang mang dư luận và e sợ cho các nhà quản lý. ðặc biệt, trong chiến dịch tăng cường kiểm tra Clenbuterol do Cục Chăn nuôi tổ chức, Viện KHKTNN Miền Nam
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1
công bố 6,3% số mẫu thịt ñược xét nghiệm chứa Clenbuterol. Trong khi ñó, khi kiểm tra các mẫu nghi ngờ, Chi cục Thú Y TP HCM phát hiện 16% mẫu thịt dương tính với Clenbuterol. Gần ñây, kết quả kiểm tra trong 3 tháng ñầu năm 2012 của Cục Chăn nuôi khi kiểm tra 268 mẫu thức ăn, 179 mẫu thịt, gan lợn và 18 mẫu thuốc thú y nghi ngờ ñể kiểm tra ñã phát hiện 4,8% mẫu thức ăn chăn nuôi, 4,4% mẫu thịt và hơn 11% mẫu thuốc thú y dương tính với beta-agonist (Bộ NN&PTNT, 2012).
Trong quá trình kiểm tra, do năng lực của các phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế, chưa ñạt chuẩn nên gặp nhiều khó khăn, chưa ñáp ứng yêu cầu thực tế, ñặc biệt do phương pháp, qui trình phân tích của các phòng thí nghiệm khác nhau, kết quả phân tích chưa thống nhất và tin cậy nên nhiều công bố ñã gây thiệt hại ñáng kể cho ngành chăn nuôi Việt Nam.
Chính vì vậy, ngày 07/11/2012, Bộ Nông nghiệp và PTNT ñã ban hành Thông tư số 57/2012/BNNPTNT Ban hành Quy ñịnh việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist trong chăn nuôi, một trong các nội dung quan trọng nhất của phương pháp này liên quan ñến qui trình phân tích, phương pháp thử nhanh và ELISA muốn ñược công nhận kết quả phải có giới hạn phát hiện nhỏ hơn 0,2 ppb (Bộ NN&PTNT, 2012). Kể từ ñó nhiều phòng thí nghiệm ñã ñược trang bị hệ thống ELISA, nhiều lớp tập huấn về ký thuật phân tích nhưng việc sử dụng ñể phân tích, ñặc biệt phân tích các chất cấm như Clenbuterol còn rất hạn chế. ðặc biệt yêu cầu qui trình phân tích từ sàng lọc ñến khẳng ñịnh phải có khả năng phát hiện tối thiểu là 0,2 ppb ñã buộc các phòng thí nghiệm phải ñánh giá lại các phương pháp ñang ñược áp dụng, trong ñó có phương pháp EILSA.
Xuất phát từ thực tế ñó việc ñánh giá thực trạng sử dụng thuốc và hóa chất trong chăn nuôi và triển khai ñánh giá các phương pháp có ñộ chính xác, ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu cao như phương pháp hóa miễn dịch enzyme (ELISA) ñể kiểm soát tình trạng tồn dư thuốc thú y nói chung và Clenbuterol nói riêng trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2
thức ăn chăn nuôi theo qui ñịnh mới là hết sức cấp bách. Không chỉ ñảm bảo qui ñịnh trong thông tư 57/2012/BNNPTNT của Bộ NN&PTNT mà còn phục vụ cho sự phát triển chăn nuôi bền vững, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng trong nước. Trước yêu cầu ñó, nghiên cứu tiến hành “ðánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp ELISA ñể phát hiện Clenbuterol có trong thịt và thức ăn chăn nuôi lợn”.
Mục ñích ñề tài:
- ðánh giá tình hình kinh doanh hóa chất và thuốc thú y dùng trong chăn nuôi thú y ở tại một số tỉnh khu vực ñồng bằng sông Hồng.
- ðánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp ELISA ñể phát hiện Clenbuterol có trong thịt và thức ăn chăn nuôi lợn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số thông tin chung về Clenbuterol
β-agonists là nhóm các hormone tự nhiên, có nguồn gốc từ các Catecholamines (Adrenaline, Noradrenaline và Dopamine), có tác dụng làm giãn cơ cuống phổi, giãn cơ tử cung, ñồng thời kích thích giải phóng insulin và quá trình phân giải glucose nên ñược sử dụng ñể ñiều trị bệnh hen suyễn ở người và ñộng vật. Nếu sử dụng kéo dài có tác dụng tăng cường tổng hợp protein, tăng tỷ lệ nạc, giảm tích mỡ. Tuy nhiên, nếu thức ăn có nguồn gốc từ ñộng vật bị nhiễm các chất này có thể gây ra các biến chứng liên quan ñến tim mạch, hệ thần kinh trung ương...
Côngthứcphântử của Clenbuterol làC12H18N2Cl12(IUPAC): 4-amino- 3,5-dichloro-phenyl hay (tert-butylamino) ethanol Mol. weight: 277.19 thường ở dạng tinh thể không màu, bền với nhiệt, có khả năng hòa tan trong nước và một số dung môi hữu cơ như aceton, methanol và ethanol (Bảng 1.1).
Mặc dù beta-agonist ñã ñược phát hiện ñã từ lâu, nhưng ñến năm 1903, beta-agonist ñược tổng hợp lần ñầu tiên và mới ñược công nhận như thuốc. Từ những nghiên cứu phát hiện những tác dụng tích cực của beta-agonist, ñặc biệt là Isoproterenol trong những năm 1940, Isoetharine năm 1951 và Metaproterenol năm 1961 mà các chất thuộc nhóm beta-agonist mới ñược sử dụng trong ñiều trị hen, suyễn ở người và ñộng vật.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4
Bảng 1.1. Một số ñặc ñiểm cấu tạo và tính chất lý hóa của Clenbuterol và salbutamol
1.1.1. Cơ chế tác dụng của β-agonist
Tác dụng chữa bệnh hen suyễn ở người và ñộng vật do nhóm β-agonist có
khả năng làm tăng lượng AMP vòng do ức chế phosphodiesterase làm giãn cơ trơn khí quản. ðồng thời ức chế adenosin tại ñiểm tiếp nhận do adenosin gây co thắt khí quản và tăng phóng thích histamin từ tế bào phổi, làm ổn ñịnh màng tế bào nên giảm tiết các chất trung gian, tăng sự vận chuyển chất nhầy trên ñường hô hấp.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5
ðối với mô cơ: ñể phát huy tác dụng, nhóm β-agonist thường thông qua các ñiểm tiếp nhận β nằm trong các loại tế bào trong cơ thể, bao gồm tế bào thần kinh, ñặc biệt tế bào cơ và tế bào mỡ. Theo Beermann và cs. (1984), β-agonists là tác nhân phân phối mỡ, làm giảm sự tổng hợp và tích lũy mô mỡ trên cơ thể gia súc, gia cầm. Tuy nhiên, ñể ñạt ñược kết quả này, cần sử dụng liều gấp 5-10 lần so với liều ñiều trị thông thường.
Kết quả một số nghiên cứu khác ñã cho biết β - agonists là yếu tố cần thiết trong việc mở ñầu kích thích sự phát triển của cơ (Maltin và cs., 1987). Dưới tác ñộng của β - agonists, khả năng gia tăng protein trong cơ là do sự giảm thoái biến protein và ñồng thời gia tăng tổng hợp protein.
1.1.2. Dược ñộng học của β-agonists
β-agonists hấp thu tốt khi cấp qua ñường uống cho ñộng vật thí nghiệm, người và các loài khác. Ngoài ra, các hợp chất thuộc nhóm này còn có thể hấp thu qua ñường hô hấp, ñặc biệt salbutamol nên ñược ứng dụng ñể ñiều trị hen suyễn trên người. Khi vào cơ thể bằng ñường uống, beta-agonist ñược hấp thu dọc theo ñường tiêu hóa từ dạ dày ñến ruột và một phần tái hấp thu ở thận.
Ở hầu hết các loài ñộng vật, khi thử nghiệm ñều co thấy β-agonists vào cơ thể bằng ñường miệng có thể ñạt nồng ñộ cao nhất trong máu sau 2-4 giờ và phân bố khắp các mô. Thử nghiệm trên chuột, chó, khỉ, bò cho thấy Clenbutrol lưu lại lâu nhất ở gan, thận và một phần clenbuterol và salbutamol không chuyển hóa kịp sẽ ñược tích lũy trong một số mô với nhiều mức ñộ khác nhau như mật, mắt, sau ñó giảm dần theo thời gian khi ngừng sử dụng.
Ở hầu hết các loài ñộng vật, khi thử nghiệm ñều cho thấy clenbutrol ñược bài tiết nhiều nhất qua phân và nước tiểu ở dạng nguyên chất. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong vòng 96 giờ có 74% thuốc ñã ñược bài tiết, 30% trong nước tiểu và 44 % trong phân. Ở gia súc, uống salbutamol với liều 1mg/kg thể trọng thì sau 8 giờ nó bài thải khoảng 40-70% qua nước tiểu. Trong ñó, khoảng 48% liều ở dạng không hoạt tính và 24-33% ở dạng có hoạt tính.
Tại Việt Nam, sau công bố của các phòng thí nghiệm khu vực phía nam thực hiện ñã gây ảnh hưởng rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng vào năm 2010 và năm 2011 Bộ Nông nghiệp & PTNT ñã ban hành thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012) về việc giám sát chất cấm trong chăn nuôi. Theo qui ñịnh của thông tư, khi phân tích mẫu có thể sử dụng một trong hai cách sau:
a. Cách thứ nhất (áp dụng trong trường hợp cần kết quả kiểm tra nhanh): Tiến hành phân tích ñịnh tính bằng kit thử nhanh hay phân tích bán ñịnh lượng bằng kit ELISA chung cho nhóm Beta-agonist hay ñịnh tính riêng cho từng chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine. Giới hạn phát hiện (LOD) của kit thử nhanh và kit ELISA phải nhỏ hơn 0,2 ppb. Nếu kết quả âm tính thì kết thúc quá trình kiểm tra.
Nếu kết quả dương tính phải tiếp tục phân tích ñịnh lượng bằng phương pháp sắc ký ñể khẳng ñịnh mẫu có thực sự dương tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist hay không.
b) Cách thứ hai: dùng phương pháp phân tích ñịnh lượng bằng phương pháp sắc ký ñối với các chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopamine.
ðặc biệt một ñiểm mới khác cần ghi nhận ở thông tư này ñã qui ñịnh việc xử lý kết quả rất cụ thể và ñảm bảo ñược sự chính xác về thông tin kết quả. Nếu kết quả âm tính bằng các phương pháp phân tích trên thì khẳng ñịnh mẫu không vi phạm (hay mẫu âm tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Kết quả dương tính bằng phân tích ñịnh lượng là cơ sở ñể xử lý vi phạm và công bố mẫu vi phạm (hay mẫu dương tính với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Căn cứ ñể khẳng ñịnh mẫu dương tính ñược quy ñịnh tại Phụ lục II ban hành kèm theo Thông tư này. Mẫu ñược coi là dương tính khi có kết quả phân tích ñịnh lượng cao hơn hay bằng một trong các giá trị (tính bằng ppb) nêu tại bảng 1.3.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links