Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN................................................................................................2
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh............................................................................................2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh .........................................................................................................2
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ..........................................................................................2
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh .....................................................................................2
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh ..............................................................................................3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes) ....................................................................3
1.2.1. Đại cương về xạ khuẩn ........................................................................................................3
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ............................................................................4
1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn......................................................................5
1.3.1. Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn .....................................................................5
1.3.2. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ...........................................................................5
1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ...............................6
1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ...................................................7
1.4.1. Mục đích .............................................................................................................................7
1.4.2. Sàng lọc ngẫu nhiên ............................................................................................................7
1.4.3. Đột biến cải tạo giống .........................................................................................................8
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn ....................................................................................................9
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh...........................................................................9
1.5.1. Khái niệm lên men ..............................................................................................................9
1.5.2. Các phương pháp lên men .................................................................................................10
1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................................................10
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...............................................11
1.6.1. Chiết xuất ..........................................................................................................................11
1.6.2. Tách, tinh chế sản phẩm: ...................................................................................................11
1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ............................................................................12
1.7.1. Phổ tử ngoại ......................................................................................................................12
1.7.2. Phổ hồng ngoại ..................................................................................................................13
1.7.3. Khối phổ (MS) ..................................................................................................................13
1.8. Các nghiên cứu liên quan:.......................................................................................13
1.8.1. Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự tính kiểm soát phiên
mã ...........................................................................................................................................13
1.8.2. Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và
S.parvulus sinh actinomycin ........................................................................................................14
1.8.3. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển ........ 15
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị.......................................................................................16
2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................................16
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ.............................................................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................18
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm ......................................................................................18
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn.........................................................................................18
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán............................................18
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên ...........................................................................................................20
2.3.4. Đột biến..............................................................................................................................20
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh....................................................................................21
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men ..........................................................22
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ...................................................22
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng............................................23
2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................................................................24
2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ........................................................................24
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được...............................................................24
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ....................................................................25
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ...................................................................................25
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .......................................................................26
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 .......................................................................27
3.4. Kết quả đột biến hóa học.........................................................................................28
3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh............................................................30
3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt của kháng sinh trong dịch lọc..............31
3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết .......................................................................32
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ..........................................................33
3.9. Kết quả sắc ký cột ....................................................................................................34
3.9.1. Chạy cột sắc ký lần 1..........................................................................................................34
3.9.2. Chạy cột sắc ký lần 2..........................................................................................................36
3.9.3. Chạy cột sắc ký lần 3..........................................................................................................39
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết ...................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................42
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cách đây hơn 70 năm, Penicillin – kháng sinh đầu tiên ra đời có khả năng
tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ đã mở ra một tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân
nhiễm khuẩn. Nhưng đến nay cuộc chiến giữa kháng sinh và vi khuẩn vẫn tiếp diễn,
nhiều loại vi khuẩn tưởng đã bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị nhưng giờ
đây vẫn còn hiện diện và đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh. Điều hết sức đáng
sợ trong những năm vừa qua là song song với việc phát hiện thêm các chủng vi
khuẩn siêu kháng thuốc thì tốc độ tìm ra các loại kháng sinh mới lại không hề theo
kịp tốc độ phát triển của các loại vi khuẩn.
Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe
dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh
là một trong những vấn đề gây lo ngại và trở thành mối quan tâm nghiên cứu của
những nhà khoa học. Phương pháp chủ yếu để tìm ra kháng sinh hiện nay vẫn là
phương pháp sinh học- các kháng sinh mới có thể được tổng hợp rất phong phú từ
vi khuẩn, xạ khuẩn hay nấm.
Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên rất đa dạng là điều kiện thuận lợi
cho sự sinh sôi phát triển của hệ vi sinh trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces với khả năng
tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm nhất. Chính vì thế chúng tôi
lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
chủng Streptomyces 168.27.
- Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc,
dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết.
- Sơ bộ xác định một số đặc tính của kháng sinh đã thu được.
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là tất cả những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, có
tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như
cả với các tế bào ung thư) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hay tác dụng yếu
lên người, động vật hay thực vật bằng con đường cung cấp chung [6, 18].
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 5 kiểu chủ yếu [3,
18] :
• Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt. Một số kháng sinh
như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo cơ chế này.
• Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK:
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol,
tetracyclin, macrolid và lincosamid.
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm tiêu diệt VK: Các
aminoglycosid, spectinomycin.
• Ức chế tổng hợp acid nucleic từ quá trình sao chép và phiên mã:
Actinomycin, antracyclin, rifampicin.
• Thay đổi tính thấm của màng: Polymycin, amphotericin.
• Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol và
trimethoprim).
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh
Những yêu cầu của y học đối với một kháng sinh là [6]:
• Kháng sinh phải không độc hay rất ít độc đối với cơ thể.
• Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh.
• Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài.
• Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể.
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh
• Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn, nhiễm nấm và một số bệnh ung thư [3].
• Trong lĩnh vực khác:
– Trong chăn nuôi: Kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin
điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như
chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng
trứng ở gà, vịt [6, 10].
– Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để xử lý hạt, đất trồng, kích
thích hạt nảy mầm và tiêu diệt nấm, các VK gây bệnh cho cây trồng (Validamycin
dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả) [6].
–
: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis
tạo ra) [6].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes)
1.2.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh
có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ
khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh. Do có thể sinh
tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được rất
nhiều các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu [10, 11]
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN................................................................................................2
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh............................................................................................2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh .........................................................................................................2
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ..........................................................................................2
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh .....................................................................................2
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh ..............................................................................................3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes) ....................................................................3
1.2.1. Đại cương về xạ khuẩn ........................................................................................................3
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ............................................................................4
1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn......................................................................5
1.3.1. Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn .....................................................................5
1.3.2. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh ...........................................................................5
1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ...............................6
1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ...................................................7
1.4.1. Mục đích .............................................................................................................................7
1.4.2. Sàng lọc ngẫu nhiên ............................................................................................................7
1.4.3. Đột biến cải tạo giống .........................................................................................................8
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn ....................................................................................................9
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh...........................................................................9
1.5.1. Khái niệm lên men ..............................................................................................................9
1.5.2. Các phương pháp lên men .................................................................................................10
1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................................................10
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...............................................11
1.6.1. Chiết xuất ..........................................................................................................................11
1.6.2. Tách, tinh chế sản phẩm: ...................................................................................................11
1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ............................................................................12
1.7.1. Phổ tử ngoại ......................................................................................................................12
1.7.2. Phổ hồng ngoại ..................................................................................................................13
1.7.3. Khối phổ (MS) ..................................................................................................................13
1.8. Các nghiên cứu liên quan:.......................................................................................13
1.8.1. Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự tính kiểm soát phiên
mã ...........................................................................................................................................13
1.8.2. Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và
S.parvulus sinh actinomycin ........................................................................................................14
1.8.3. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển ........ 15
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị.......................................................................................16
2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................................16
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ.............................................................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................18
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm ......................................................................................18
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn.........................................................................................18
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán............................................18
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên ...........................................................................................................20
2.3.4. Đột biến..............................................................................................................................20
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh....................................................................................21
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men ..........................................................22
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ...................................................22
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng............................................23
2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................................................................24
2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ........................................................................24
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được...............................................................24
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ....................................................................25
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ...................................................................................25
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .......................................................................26
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 .......................................................................27
3.4. Kết quả đột biến hóa học.........................................................................................28
3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh............................................................30
3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt của kháng sinh trong dịch lọc..............31
3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết .......................................................................32
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ..........................................................33
3.9. Kết quả sắc ký cột ....................................................................................................34
3.9.1. Chạy cột sắc ký lần 1..........................................................................................................34
3.9.2. Chạy cột sắc ký lần 2..........................................................................................................36
3.9.3. Chạy cột sắc ký lần 3..........................................................................................................39
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết ...................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................42
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cách đây hơn 70 năm, Penicillin – kháng sinh đầu tiên ra đời có khả năng
tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ đã mở ra một tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân
nhiễm khuẩn. Nhưng đến nay cuộc chiến giữa kháng sinh và vi khuẩn vẫn tiếp diễn,
nhiều loại vi khuẩn tưởng đã bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị nhưng giờ
đây vẫn còn hiện diện và đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh. Điều hết sức đáng
sợ trong những năm vừa qua là song song với việc phát hiện thêm các chủng vi
khuẩn siêu kháng thuốc thì tốc độ tìm ra các loại kháng sinh mới lại không hề theo
kịp tốc độ phát triển của các loại vi khuẩn.
Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe
dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh
là một trong những vấn đề gây lo ngại và trở thành mối quan tâm nghiên cứu của
những nhà khoa học. Phương pháp chủ yếu để tìm ra kháng sinh hiện nay vẫn là
phương pháp sinh học- các kháng sinh mới có thể được tổng hợp rất phong phú từ
vi khuẩn, xạ khuẩn hay nấm.
Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên rất đa dạng là điều kiện thuận lợi
cho sự sinh sôi phát triển của hệ vi sinh trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces với khả năng
tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm nhất. Chính vì thế chúng tôi
lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
chủng Streptomyces 168.27.
- Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc,
dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết.
- Sơ bộ xác định một số đặc tính của kháng sinh đã thu được.
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là tất cả những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, có
tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như
cả với các tế bào ung thư) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hay tác dụng yếu
lên người, động vật hay thực vật bằng con đường cung cấp chung [6, 18].
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 5 kiểu chủ yếu [3,
18] :
• Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt. Một số kháng sinh
như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo cơ chế này.
• Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK:
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol,
tetracyclin, macrolid và lincosamid.
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm tiêu diệt VK: Các
aminoglycosid, spectinomycin.
• Ức chế tổng hợp acid nucleic từ quá trình sao chép và phiên mã:
Actinomycin, antracyclin, rifampicin.
• Thay đổi tính thấm của màng: Polymycin, amphotericin.
• Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol và
trimethoprim).
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh
Những yêu cầu của y học đối với một kháng sinh là [6]:
• Kháng sinh phải không độc hay rất ít độc đối với cơ thể.
• Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh.
• Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài.
• Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể.
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh
• Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn, nhiễm nấm và một số bệnh ung thư [3].
• Trong lĩnh vực khác:
– Trong chăn nuôi: Kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin
điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như
chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng
trứng ở gà, vịt [6, 10].
– Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để xử lý hạt, đất trồng, kích
thích hạt nảy mầm và tiêu diệt nấm, các VK gây bệnh cho cây trồng (Validamycin
dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả) [6].
–
: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis
tạo ra) [6].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes)
1.2.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh
có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ
khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh. Do có thể sinh
tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được rất
nhiều các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu [10, 11]
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links