Download miễn phí Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym - Galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16
LỜI MỞ ĐẦU 3
PHẦN I: TỔNG QUAN 5
I.1. Sơ lược về enzym -galactosidaza 5
I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hơp enzym -galactosidaza 5
I.1.2. Đặc tính enzym -galactosidaza từ vi sinh vật 6
I.2. Các nguồn enzym -galactosidaza 7
I.2.1. Enzym -galactosidaza từ vi khuẩn 7
I.2.2. Enzym -galactosidaza từ nấm mốc 8
I.2.3. Enzym -galactosidaza từ thực vật 8
I.3.Một số cơ chế của các phản ứng được xúc tác bởi enzym -galactosidaza 9
I.3.1. Cơ chế động học của phản ứng ONPG 9
I.3.2. Cơ chế động học của phản ứng lactoza 10
I.3.3. Cơ chế thuỷ phân lactoza của -galactosidaza có pH trung tính 11
I.4. Sự điều hoà sinh tổng hợp enzym -galactosidaza của vi sinh vật 13
I.5. Tách chiết và tinh chế enzym 14
I.5.1. Tách chiết 14
I.5.2. Tinh chế 14
I.6. Ứng dụng của enzym -galactosidaza 16
I.6.1. Ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các thành phần của sữa 16
I.6.2. Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza 19
I.6.3. Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein 20
I.7. Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tương lai 21
I.8. Khả năng ứng dụng của enzym -galactosidaza trong tương lai 22
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
II.1. Nguyên liệu 23
II.2. Hoá chất 24
II.3. Thiết bị 24
II.4. Các phương pháp nghiên cứu 25
II.4.1. Nhuộm gram 25
II.4.2. Xác định định tính enzym -galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal 27
II.4.3. Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza nội bào 27
II.4.4. Xác định hoạt độ enzym -galactosidaza ngoại bào 30
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
III.1. Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng 32
III.2. Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cácbon khác nhau 33
III.3. Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men 35
III.4. Xác định một số đặc tính enzym -galactosidaza thu được 38
III.4.1. Ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ của enzym 38
III.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ của enzym 40
III.4.3. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym 41
III.4.4. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym 42
III.5. Nghiên cứu khả năng thu enzym nội bào 43
III.6. Nghiên cứu khả năng kết tủa enzym bằng muối amonsunfat 45
KẾT LUẬN 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.
Ketnooi -
Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ketnooi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hay pH môi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzym bền nhiệt hay bền axit. Dịch enzym được giữ ở 50 đến 700C hay ở pH = 5 hay nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hay ly tâm.
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ. tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (00C).
Phương pháp hấp thụ chọn lọc được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Chất hấp thụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách là chất hấp thụ protein tạp hay hấp thụ enzym. Quá trình hấp thụ thường được tiến hành ở 00C. Enzym sau đó dược chiết bằng các dung môi thích hợp.
Phương pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hay dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hay dẫn xuất este của xelluloza. Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE – xenlluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ cả các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hay streptomixinsufat thường dùng trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhièu chất trên cột sephadex, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong cột, các phân tử có kích thước lớn không có khả năng đi vào sẽ được chiết ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các chất trong hỗn hợp. Sự chênh lệch nhiều về phân tử lượng của các enzym (12.700 – 1.000.000 Da) cho phép tách và làm sạch enzym bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng [1].
Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho mọi enzym. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau.
I.6. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM b-GALACTOSIDAZA:
I.6.1 Ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa:
Enzym b-galactosidaza thuỷ phân các gốc b-galactosidaza tận cùng đều không khử của các b-D-galactosit thành các oligosaccarit bao gồm cả lactoza. Lactoza là disaccarrit bao gồm galactoza và glucoza, trong sữa bò nó chiếm khoảng 40% trọng lượng chất khô.
Việc tách loại lactoza khỏi các sản phẩm thực phẩm là cần thiết đối với đại đa số người tiêu dùng - những người bị thiểu năng chuyển hoá lactoza với các triệu chứng đau bụng, khó tiêu khi dùng lactoza. Tuy nhiên, các sản phẩm thủy phân của lactoza bao gồm glucoza và galactoza đều dễ hấp thụ qua đường tiêu hoá và dễ đồng hoá.
Lactoza trong sữa cũng có thể gây ra một số khó khăn trong quá trình chế biến phomat. Quá trình sản xuất phomat tạo ra một lượng lớn dịch sữa “whey” dưới dạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên. Dịch sữa này là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực thực phẩm cũng như thức ăn gia súc. Vấn đề là lactoza không hoà tan hoàn toàn và có xu hướng kết tinh từ dung dịch này. Điều này làm cho việc vận chuyển dich sữa là khó khăn, đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do vậy mỗi năm người ta phải đổ đi một lượng lớn dịch sữa.
Lactoza có thể được thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ phân bằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong quá trình chế biến.
Cách tốt hơn là sử dụng enzym b-galactosidaza. Enzym này đã được tìm thấy trong nhiều hệ vi sinh vật. Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm men, nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thương mại chính.
Một quá trình khả thi về mặt kỹ thuật và công nghệ khi sử dụng enzym này để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đông tụ sữa chua hay dịch permeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về công nghệ như hiện tượng “lên cát” ở kem, hay hiện tượng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa như dịch sau đông tụ phomat. Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học của enzym b-galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần chính phụ của ngành công nghiệp chế biến sữa.
Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những người bệnh bị thiểu năng chuyển hoá lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ phân này, đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh. Vì vậy, người ta mong muốn sản xuất ra sữa có hàm lượng lactoza thấp sao cho mọi người đều có thể dụng các sản phẩm từ nó.
Việc lựa chọn công nghệ cho quá trình thuỷ phân tuỳ từng trường hợp chủ yếu vào đặc tính và các chi phí sản xuất, tàng trữ và tiếp thị sản phẩm. Quy trình công nghệ khả thi bao gồm bổ sung trực tiếp enzym hoà, tan, tái tuần hoàn enzym hoà tan bằng quy trình màng hay sử dụng enzym cố định. Mặt khác, ở những phân xưởng nhỏ sản xuất các sản phẩm từ sữa cũng có thể sử dụng các sản phẩm enzym ở dưới dạng canh trường nuôi cấy một cách đơn giản.
Vấn đề khó nhất khi sử dụng b-galactosidaza là khó đạt được thuỷ phân hoàn toàn vì 2 lý do sau:
Enzym này là sản phẩm bị ức chế bởi glucoza được tạo ra trong quá trình phản ứng.
Enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tổng hợp các đồng phân liên kết b 1-6 của lactoza và các chất khác ngoài lactoza.
Đối với mục đích sử dụng thuỷ phân lactoza các hướng chính hiện nay là:
Sử dụng enzym cố định
Có rất nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về sử dụng enzym b-galactosidaza cố định nhưng cho đến nay áp dụng nó vào quy mô công nghiệp vẫn gặp nhiều khó khăn. Enzym này được cố định trên một loạt các chất mang vô cơ, Shepadex, DEAE-xenllulose, thuỷ tinh xốp hay bẫy vào trong gel polyacrylamit… Enzym cố định được sử dụng cả trong các thiết bị phản ứng liên tục và gián đoạn [9].
Sử dụng ở dạng liposom sấy khô có chứa b-galactosidaza để thuỷ phân lactoza trong sữa.
Liposom bao gồm một màng kép lipit gi