Link tải luận văn miễn phí cho ae
MỞ ĐẦU
Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency Virus
HIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch
sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV
type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca
nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28].
Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu
trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã
ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba
enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng
nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh
nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo
hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus
ART (antiretroviral drug therapy) [28].
Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi
gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các
protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu
protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn
chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt
virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là
1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm
bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI)
chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức
chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease
một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình
nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên
việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết.
Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1
trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu
hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu
đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để
sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn.
Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia
coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy
nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ
mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng
cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện
ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến
sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ
thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men
có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là
một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào
nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia
pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo
dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli
hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].
Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên
của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,
cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli,
chúng tui đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa
protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung:
- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
pastoris.
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV
1.1.1. Nguyên nhân hình thành AIDS
Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy
giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà
lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát
và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên
quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã
trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây
nên [38]. Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại
Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris
thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV).
Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Cũng
vào 1986, L. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt
tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều
làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV. Chúng
giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng
pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và
HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc
hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1.
Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV-
1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm
chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất
hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân
type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K
và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant
forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit
amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
MỞ ĐẦU
Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency Virus
HIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch
sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV
type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca
nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28].
Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu
trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã
ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba
enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng
nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh
nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo
hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus
ART (antiretroviral drug therapy) [28].
Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi
gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các
protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu
protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn
chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt
virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là
1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm
bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI)
chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức
chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease
một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình
nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên
việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết.
Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1
trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu
hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu
đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để
sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn.
Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia
coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy
nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ
mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng
cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện
ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến
sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ
thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men
có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là
một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào
nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia
pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo
dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli
hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].
Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên
của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,
cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli,
chúng tui đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa
protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung:
- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
pastoris.
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV
1.1.1. Nguyên nhân hình thành AIDS
Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy
giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà
lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát
và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên
quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã
trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây
nên [38]. Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại
Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris
thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV).
Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Cũng
vào 1986, L. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt
tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều
làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV. Chúng
giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng
pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và
HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc
hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1.
Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV-
1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm
chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất
hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân
type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K
và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant
forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit
amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links