hr_10012002
New Member
Download Đề tài Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)
Nuôi tôm đang là thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Từ năm 1995 nghề nuôi tôm nước ta phát triển mạnh mẽ cả về diện tích, hình thức nuôi, năng suất, sản lượng và hiệu quả kinh tế. Cụ thể là năm 2004 diện tích tôm nuôi đạt hơn 460.000ha, tổng sản lượng đạt 350.000 tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế biến xuất khẩu thủy sản. Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam.
Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh do virus gây ra cũng liên tục lan rộng và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Trong khi đó, những nghiên cứu về virus tôm còn rất hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus gây bệnh nhằm đề xuất giải pháp hạn chế tác nhân này là một yêu cầu cấp bách hiện nay. Bên cạnh đó, việc khai thác tiềm năng và phát triển thêm các chủng loại tôm nuôi khác để đa dạng hóa các sản phẩm tôm thương mại, tận dụng tối đa điều kiện tự nhiên và nhân lực ở các vùng ven biển cũng là vấn đề hiện đang rất được nhà nước quan tâm. Năm 2001 Việt Nam bắt đầu du nhập tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) từ Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng. Tôm thẻ chân trắng có những ưu thế so với tôm sú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa virus hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam. Để tránh không xảy ra dịch bệnh như đã có đối với các nước từng du nhập tôm thẻ chân trắng (TCT) thì những thông tin đầy đủ về bệnh hội chứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được quan tâm.
TS. Văn Thị Hạnh
TS. Nguyễn Ngọc Hải
CN. Lê Phúc Chiến
Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh
Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura ở tôm thẻ chân
trắng và mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm càng
xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9.
Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng protein của Red - Tail Virus
(RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây
nhiễm thực nghiệm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng của RTV được nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành
phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên
cứu tiếp theo.
Những kết quả thu được:
1. Sử dụng RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ chân trắng được nhân lên trong tế bào
côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú và tôm thẻ thành công.
2. Xác định được các protein của RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ được nuôi cấy
trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate –
Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot)
vi
Mục lục ......................................................................................................................... .vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... ...ix Danh mục các hình ....................................................................................................... .x Danh mục các bảng....................................................................................................... .xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... ..1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... ..3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ........................................................................... ..3
2.1.1 Hiện trạng chung............................................................................................. ..3
2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới ........................................................................ ..4 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ........................................................................... ..4 2.2.1 Hiện trạng chung............................................................................................. ..4 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam....................................................................... ..5 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) .............................................. ..6 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura ............................................................ ..6 2.3.2 Phân loại và tên gọi ...................................................................................... ..7 2.3.2.1 Tên gọi .................................................................................................. ..7 2.3.2.2 Vị trí phân loại ...................................................................................... ..7 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV ..........................................................7 2.3.4 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm......................................................... ..8 2.3.5 Vật chủ .......................................................................................................... ..9 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới ........................... 10 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV ............................................................... 10 2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới .......................................................... 10
vi
2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura ............................................................ 12
2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa.................................. 12 2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura .......................................... 13 2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng ................................................... 13 2.4.2 Phương pháp mô học..................................................................................... 14 2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học ................................................................ 14 2.4.4 Phương pháp miễn dịch................................................................................. 14 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) ............................ 14
2.4.6 Phương pháp RT-PCR ...............................................................................15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 16
3.2 Hoá chất, thiết bị, công cụ và vật liệu ................................................................... 16 3.2.1 Hóa chất ......................................................................................................... 16 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel.................................................. 16 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE .......................................... 16 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel ............................................................ 16 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting.................................. 16 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot ...................................................... 17 3.2.2 Thiết bị, công cụ .......................................................................................... 17 3.2.3 Vật liệu .......................................................................................................... 18 3.2.3.1 Kháng thể ................................................................................................ 18 3.2.3.1 Mẫu........................................................................................................... 18
3.3 Phương pháp ......................................................................................................... 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE............................................................................. 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ....................................................................................... 18 3.3.1.1 Nguyên tắc............................................................................................... 18 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành ........................................................................... 20 3.3.2 Phương pháp Western Blot ........................................................................21
vii
3.3.2.1 Nguyên tắc............................................................................................... 21 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành............................................................................ 23
3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 ................................................. 26
3.3.4 Phương pháp Dot Blot................................................................................... 27
3.3.4.1 Nguyên tắc............................................................................................... 27
3.3.4.2 Phương pháp tiến hành.............................................................................. 27
3.3.5 Phương pháp sắc ký ...................................................................................28
3.3.5.1 Nguyên tắc ............................................................................................. 28 3.3.5.2. Phương pháp tiến hành............................................................................ 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 30 4.1 Kết quả SDS – PAGE ...................................................................................... 30 4.2 Kết quả Western Blot ...................................................................................... 32 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ................................................... 34 4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus .......................................................................... 37 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel ...................................................................................... 40
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 42 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 42 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 42
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 43 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................................. 47 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................. 48 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................. 50 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................. 52
Phương pháp này chủ yếu dựa trên khả năng khác nhau của các phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hay chui qua lỗ của các rây phân tử tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do (pha động) và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp (pha tĩnh). Mức độ thâm nhập của các phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng. Các đại phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ không thể thâm nhập vào các lỗ, các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước các lỗ có khả năng thâm nhập vào lỗ. Khi dòng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động.
3.3.5.2. Phƣơng pháp tiến hành
1. Chuẩn bị gel
Gel sử dụng có khả năng phân tách các protein trong khoảng 5000 – 100.000 kDa
Dùng 1 cốc thủy tinh, cân 1lượng gel khô thích hợp (8,5 g gel khô) (dựa vào tỉ lệ 12 ml dung dịch đệm/1g gel khô). Sau đó cho thêm 200 ml dung dịch đệm vào rồi để yên trong 12 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Hút bỏ dịch trên, thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm để rửa gel, lập lại khoảng 4 lần.
2. Nhồi cột
Ở đây ta dùng cột có đường kính 2 cm, cao 50 cm. Đổ gel vào cột sắc ký để yên khoảng 24 giờ để gel ổn định trong cột. Sau đó rửa cột bằng đệm trong 2 giờ.
3. Đưa mẫu vào cột
Thực hiện sắc ký trên các dịch protein. Đưa mẫu vào cột cùng với dòng dung môi vì đưa mẫu như vậy không làm xáo trộn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để mẫu ngấm xuống thì đặt ống nghiệm bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2 ml dịch lọc, tốc độ chảy 0,14 ml/phút.
4. Lượng mẫu đưa vào cột
Lượng mẫu đưa vào cột phụ thuộc độ nhạy của bộ phận phát hiện mẫu, kích
thước lỗ của gel, nồng độ mẫu có thể từ 2 – 100mg/ml. Thể tích mẫu đưa vào cột không quá 2% thể tích cột.
29
5. Thu mẫu
29
Để thu mẫu, dùng máy thu mẫu phân đoạn tự động gồm 80 ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và khi đủ 2 ml máy sẽ di chuyển sang ống khác. Mẫu thu được trong các ống nghiệm sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
30
30
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả SDS – PAGE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range
Giếng 2: dịch tế bào (DTB) Sf9
Giếng 3, 4: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV- PmLA/SL T).
Giếng 5, 6: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG).
Giếng 7, 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).
Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
31
a
> 108 kDa 108
55 51-52
40 33 31
31
108,5 kDa 98,7
54,6
33,5 29,5
19,8
kDa
28 24
17-19
Nhận xét
Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng
<17
Tên mẫu
<17 <17 <17 17 17 17 19 19 19
24 24 24 28 28 28 31 31 31 33 33 33
40 40 40 51-52 51-52 51-52
40 51-52
lượng của các protein đã được công bố.
Các protein của TSV đã được công bố
23 24 24
36,8 40 40 49
51,5 52,5
55 58
Bảng 4.4 cho thấy các mẫu nhiễm virus có nhiều vạch khác so với tế bào đối chứng: <17, 17, 19, 28, 31, 33, 40, 51, 52, 55, 108 và một vạch > 108 kD. Các mẫu nhiễm virus về cơ bản có các protein giống với các protein của TSV đã được công bố. Trong đó, protein 40 kDa có thể tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998, Mari, 2002). Tuy vậy, để khẳng định sự có mặt của các vạch protein thuộc về virus, chúng tui thực hiện điện di miễn dịch (Western Blot) dùng kháng thể đặc hiệu để chỉ thị các vạch protein đã được chuyển thẩm lên màng lai.
55 55 55 55
108 108 108 >108 >108 >108
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: