luz_missngoc
New Member
Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu sản xuất Pectinmethylesterase từ Aspergillus oryzae
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
TÓM LƯỢC. ii
MỤC LỤC. iii
DANH SÁCH HÌNH . vi
DANH SÁCH BẢNG . vii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU. 1
1.1 Đặt vấn đề . 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu . 2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . 3
2.1 Giới thiệu chung. 3
2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase. 3
2.1.2 Nguồn tổng hợp pectinmethylesterase. 3
2.1.3 Giới thiệu vềpectin. 4
2.2 Cấu trúc, tính chất và cơchếhoạt động thủy phâncủa pectinmethylesterase. 6
2.2.1 Cấu trúc . 6
2.2.2 Tính chất . 6
2.2.3 Cơchếhoạt động thủy phân . 7
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính xúc tác của pectinmethylesterase. 8
2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độenzyme . 8
2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độcơchất . 9
2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ . 10
2.3.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme. 11
2.3.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm. 12
2.3.6 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá. 13
2.4 Sản xuất pectinmethylesterase từnấm mốc . 14
2.4.1 Môi trường nuôi cấy. 14
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệThực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
iv
2.4.2 Giống vi sinh vật. 15
2.4.3 Phương pháp nuôi cấy. 17
2.4.4 Thu nhận enzyme . 18
2.4.5 Kỹthuật sản xuất pectinmethylesterase. 19
a. Quy trình kỹthuật sản xuất enzyme PME . 19
b. Thuyết minh quy trình. 20
2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khảnăng tổng hợp hoạt tính của PME. 21
2.5 Một số ứng dụng của pectinmethylesterase . 22
2.5.1 Trong sản xuất nước quảvà rượu vang. 22
a. Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả . 23
b. Làm trong . 26
c. Cải thiện cấu trúc. 27
2.5.2 Trích ly dược liệu. 27
2.5.3 Trong chăn nuôi . 28
2.5.4 Những bất lợi khi sửdụng chếphẩm enzyme. 28
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM. 29
3.1 Phương tiện thí nghiệm. 29
3.1.1 Địa điểm, thời gian. 29
3.1.2 Vật liệu. 29
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu . 29
3.1.4 Thiết bị, hoá chất. 29
3.1.5 Môi trường nuôi cấy. 31
3.2 Phương pháp thí nghiệm . 31
3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi
cấy khác nhau đến sựtổng hợp pectinmethylesterase . 31
3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm, nhiệt độ, pH môi trường đến sự
tổng hợp pectinmethylesterase. 33
3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độcơchất (pectin) đến hoạt tính
của pectinmethylesterase đểxác lập phương trình Michaelis-Menten . 35
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệThực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
v
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢTHẢO LUẬN . 36
4.1 Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian
nuôi cấy đến sựtạo thành pectinmethylesterase . 36
4.2 Kết quảkhảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sựtạo thành enzyme
pectinmethylesterase . 41
4.3 Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của nồng độpectin đến khảnăng hoạt động của
pectinmethylesterase. . 48
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀNGHỊ . 50
5.1 Kết luận . 50
5.2 Đềnghị . 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO. 52
PHỤLỤC. viii
Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.
Ketnooi -
Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ketnooi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
clorua 1%, amon phosphat 2%. Độ ẩm môi trường là 60-65% . Đem môi trường thanh
trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội và
bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus oryzae vào môi trường đã được trộn đều,
trãi mỏng trên khay.
Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ úm ổn định ở nhiệt độ khoảng 37oC. Trong khoảng
36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian
enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm enzyme thô ở giai đoạn này
(Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Trích ly enzyme
Chiết tách enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối
trung tính, có thể chiết tách được 90- 95% và trong nước chiết không chứa tạp chất
không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít focmalin hay chất sát trùng khác.
Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25-28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng
ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước
bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường,
đẩy một lượng nước lớn. Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong
hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung
dịch cồn-nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và
tính chất enzyme của protein.
Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3-5oC. Khi trộn phải
khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết
tủa có nồng độ 60-70% hay có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5-5,6 bằng
(NH4)2SO4 (600g/lít).
Khi kết tủa bằng ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%,
còn nếu dùng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Khi kết tủa bằng ammonium
sulfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và
pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa
pectintranseliminase và exopolygalacturonase.
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
21
Ly tâm
Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly
tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa
enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa
tan.
Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch
enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước, protein không hoạt động và
các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, thường tiến hành ly
tâm lạnh (3- 5oC) (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
Sấy kết tủa
Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều
nước. Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi
độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%.
Nghiền và bảo quản
Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hay
túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh.
Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết
phải qua giai đoạn tinh chế.
2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính của PME
• Độ ẩm
Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát
triển của nấm sợi cũng như khả năng tạo enzyme.
• Nhiệt độ nuôi
Nhiệt độ cao quá hay thấp quá đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme.
• Thời gian nuôi
Thời gian nuôi để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thực
nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính
enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc
khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004).
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
22
• pH
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt thường ít ảnh hưởng do môi trường có dung
dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH
ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự
tạo thành enzyme.
Đa số nấm sẽ phát triển tốt và tạo ra enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể
dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm ẩm môi trường.
2.5 Một số ứng dụng của pectinmethylesterase
2.5.1 Trong sản xuất nước quả và rượu vang
Bảng 4. Một số ví dụ về ứng dụng của enzyme trong ngành sản xuất thực phẩm
(Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007)
Ngành sản xuất
thực phẩm
Enzyme sử dụng Ghi chú
Chế biến quả, SX
dịch quả
Các enzyme phân giải thành tế
bào:
pectin lyase,
pectin methylesterase,
polygalacturonase, arabanase,
các hemicellulase,
các amylase acid của nấm mốc và
glucoamylase
Các enzyme này đều tách từ
Aspergillus.
Sử dụng các pectinase làm
tăng chất lượng, năng suất,
tạo được nhiều loại sản phẩm
mới từ quả, kéo dài thời gian
bảo quản, giữ màu bền.
Bánh nướng α-amylase, xylanase,
protease, lipase,
và một số oxidoreductase,
transglutaminase
Các enzyme nhằm đảm bảo
chất lượng bột nhão dùng
làm bánh, cải thiện mùi vị và
màu sắc của sản phẩm.
Làm phomat Enzyme làm đông sữa, chủ yếu là
các asparticprotease như:
chymosin, mucorpepsin,
endo thiapepsin,
Ngoài ra còn dùng lipase,
lysozyme
Lipase, lysozyme cũng có
vai trò làm chín phomat, tăng
hương vị, chất lượng
phomat.
Chế biến sữa β-galactosidase thuỷ phân lactose
trong sữa thành glucose và
galactose. Hai đường này có độ
ngọt lớn hơn lactose.
- Sản xuất sữa không có
lactose cho những người
thiếu lactase bẩm sinh.
- Làm tăng độ ngọt của các
loại nước uống từ sữa, sữa
chua.
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
23
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học
lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước
trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất
này nằm ở thành tế bào được phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm
enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là
đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu pectin
còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao và
rất khó lọc trong.
a. Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả
Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta
chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần
nước quả thu được sẽ kéo theo lượng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành
phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào,
giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra.
Khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30% vì PME sẽ thuỷ phân
pectin tách động lên vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt
nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase
(PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn. Nhiều
trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%.
Pectin cũng chính là một trong những nguyên nhân làm cho dịch quả có tính nhớt. Độ
nhớt dịch quả cao là trở ngại lớn cho quá trình lọc hay ly tâm. Vì vậy việc sử dụng
enzyme để cắt pectin thành những phần tử nhỏ hơn sẽ góp phần đáng kể làm giảm độ
nhớt của dịch quả. Dịch quả thu được khi xử lý bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng
lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế rất rõ.
Liều lượng enzyme được sử dụng được tạo lập tuỳ theo loại quả và điều kiện công
nghệ (nhiệt độ, thời gian tác dụng, loại hình ép). Thường chúng được dùng với liều
lượng 100-150 g/tấn thịt quả. hay dùng liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho
vào là 0,03-0,05%, chế phẩm thô là 0,5-2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân
là 43-45oC. Thời gian thủy phân là 4-8 giờ.
Trong sản xuất nước quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đường , trong
thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hay nếu thu nhận dịch quả trong
thường không có hiệu suất cao. Chính vì thế người ta phải xử lí nước nho bằng chế
phẩm enzyme. Lượng enzyme sử dụng trong trường hợp làm nát nho là 0,2% so với
khối lượng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, người ta cũng xử lí
Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng
24
enzyme với liều lượng 0,2% so với...