Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1
MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu gần đây đã công bố Allicin: Có khả năng chống viêm nhiễm mạnh, tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào, tăng cường hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, ức chế sự phát triển của những tế bào ung thư [28, 44]. Rất nhiều công bố và các công ty trên thế giới đã sản xuất Allicin từ việc tạo quá trình xúc tác giữa Alliin với enzym allinase có sẵn trong tỏi. Bằng việc sử dụng Allicin chiết xuất từ Alliin có sẵn trong tỏi, các công ty trên thế giới đã sản xuất được rất nhiều loại thực phẩm chức năng cao cấp với nhiều tác dụng sinh học quí.
Dựa vào những tín hiệu của thụ thể Dectin-1, một số hợp chất tách chiết từ thực vật đã được chứng minh có khả năng điều hòa được đáp ứng viêm và điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm khuẩn nặng và choáng nhiễm trùng. Chẳng hạn, các chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đã được công bố có khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phosphoryl hóa MAPK (mitogen activated protein kinase), phản ứng oxy hóa (ROS) thông qua tín hiệu của thụ thể Dectin-1. Tuy nhiên, các chất này có nguồn gốc từ nhân sâm nên rất đắt. Do vậy, việc tìm kiếm các chất có hoạt tính dược học đối với khả năng chống viêm vẫn đang là vấn đề cấp bách để có thể thay thế một số thuốc đang sử dụng hiện nay, cũng như góp phần làm giảm bớt tỷ lệ tử vong và giá thành điều trị của bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng.
Tuy nhiên, kể cả trên thế giới và trong nước chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào đánh giá vai trò của Allicin đối với con đường tín hiệu thụ thể Dectin-1 trong quá trình điều hòa những phản ứng viêm quá mức ở vật chủ. Đặc biệt, Việt Nam là một quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, lượng dân số vào loại cao nhất thế giới nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng do viêm (inflammation) là rất cao. Cho đến nay, thì nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU). Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên cả thế giới. Với thực trạng hiện nay, thị trường trong nước vẫn chủ yếu là thuốc nhập ngoại, giá thành rất đắt và luôn bị phụ thuộc vào các công ty nước ngoài trong khi đó Việt nam lại có một tài nguyên vô cùng đa dạng về thực vật mà khả năng ứng dụng vào dược học là vô cùng phong phú. Ngoài ra việc sử dụng thuốc một cách tự ý đặc biệt là kháng sinh để chống các bệnh nhiễm trùng vẫn đang là một vấn đề cần được giải quyết. Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng. Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tui tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1” .
Mục tiêu đề tài
1. Mục tiêu chung
- Đánh giá được 1 phần hoạt tính dược học của Allicin như một loại thuốc trong quá trình điều hóa đáp ứng viêm.
2. Nội dung
- Có qui trình sản xuất Allicin từ tỏi
- Xác định được chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Allicin tổng hợp từ Alliin trong tỏi
- Đánh giá được hiệu quả của Allicin trong quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ
Miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng đối với các động vật có xương sống. Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trò như hàng rào bảo vệ đầu tiên nhưng lại không có khả năng nhận dạng lập lại các mầm bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ kháng nguyên bên ngoài xâm nhập vào cơ thể. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu của cơ thể. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu quả mới tham gia vào quá trình viêm cục bộ và bắt đầu những đáp ứng của quá trình miễn dịch đáp ứng. Vô số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh như vi khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống như trên các thụ thể riêng biệt được gọi là PAMP (pathogenic associated molecules pattern). Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng quá trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine, chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng.
1.2. KHÁI NIỆM VIÊM
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi. Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm nhờ các loại tế bào di chuyển (migrating cells ) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân , các tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian, phần lớn là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1. Các chất này lại tiếp tục hoạt hoá các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein nhờ các proteinase, các interleukin, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô, qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính. Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng. Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do qúa trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [25].
1.3. NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG
Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8]. Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7]. Thời kỳ đầu sẽ biểu hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới quá trình nhiễm trùng. Hầu hết, đó là các cytokine tiền viêm như TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, và interferon gamma (IFN gamma). Sau đó, cơ thể sẽ điều hòa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm (IL-10), các chất ức chế của thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất hoạt của IL-1) [12]. Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ được bắt đầu bằng một số sản phẩm vi khuẩn. Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuẩn gram dương như ngoại độc tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất của vỏ tế bào nấm (zymosan được phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết các thụ thể trên macrophage của vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (NFқB)) [12]. Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15]. Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào. Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng, cùng với quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [25, 21].
Hình 1: Bệnh nhân bị shock do nhiễm trùng
Bé T.T.T.P. (11 tuổi, ngụ tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu) được cấp cứu trong tình trạng shock do nhiễm trùng.
1.4. MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN
Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật. Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của cơ thể có thể cản trở quá trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh. Thứ hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hay phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong. Thứ ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh đó là các mô của tế bào macrophage truyền tín hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô và máu. Quá trình nhận dạng bằng hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể xem như có vai trò quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm.
1.4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)
1.4.1.1. Định nghĩa: Thụ thể là những protein biệt hoá để tiếp nhận các phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất).
1.4.1.2. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh
Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được chia làm ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: Thụ thể huyết thanh hay phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hay trong dịch tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19]. Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19]. Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hay gián tiếp (thông qua oposonin) [19]. Đối với In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng ở đa vị trí. Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3), và dectin-1 [20]. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và chemokine dẫn tới
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Mục tiêu đề tài 3
Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ 4
1.2. KHÁI NIỆM VIÊM 4
1.3. NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG 5
1.4. MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN 7
1.4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) 7
1.4.1.1. Định nghĩa: Thụ thể là những protein biệt hoá để tiếp nhận các phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất). 7
1.4.1.2. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh 7
1.4.1.3. Thụ thể Toll- like (TLR) 8
1.4.1.4. Thụ thể Dectin-1 9
1.4.1.5. Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật 10
1.4.1.6. Glucocorticoid 12
1.4.1.7. ROS 12
1.4.1.8. Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm 13
1.5. Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiệm in vivo sử dụng Zymosan 14
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15
1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15
1.6.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) 15
1.6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid 16
1.6.1.3. Các chất khác 16
1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 16
1.7. CÂY TỎI VÀ VAI TRÒ CỦA ALLICIN TRONG QUÁ TRÌNH KHÁNG VIÊM 18
1.7.1. Cây tỏi 18
1.7.1.1. Phân loại thực vật – Đặc điểm sinh thái 19
1.7.2. Allicin và các sản phẩm chứa Allicin 21
1.7.3. Sản xuất Allicin từ alliin có trong tỏi 23
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25
2.1.1. Động vật thí nghiệm 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột 25
2.2.2. Đánh giá hoạt tính độc tố của Allicin tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8 25
2.2.3. Sản xuất Allicin từ tỏi 26
2.2.4. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 27
2.2.4.1. Giới thiệu phương pháp 27
2.2.4.2. Nguyên tắc 27
2.2.4.3. Qui trình thí nghiệm 27
2.2.4.4. Pha dung dịch chuẩn 28
2.2.5. Phân tích hiệu quả ức chế con đường tín hiệu MAPK (p38) của Allicin khi gây viêm bằng zymosan sử dụng kỹ thuật western blot 29
2.2.6. Phân tích ức chế của Allicin trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa 29
2.2.7. Xây dựng mô hình in vivo gây bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trên chuột sử dụng zymosan 29
2.2.8. Phân tích thống kê 30
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin 31
3.2. Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tươi 31
3.3. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hửơng bởi Allicin 33
3.4. Đánh giá khả năng zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine 34
3.5. Allicin ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bởi zymosan 35
3.6. Allicin điều hòa quá trình sinh cytokine tiền viêm thông qua thụ thể Dectin-1 36
3.7. Allicin có khả năng ức chế quá trình phospho hóa MAPK (p38 và ERK1/2) trong BMDM được kích thích bởi zymonsan thông qua thụ thể Dectin-1. 38
3.8. Allicin điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1 38
3.9. Allicin bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra bởi zymosan 40
3.10. Allicin đã làm giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
KẾT LUẬN 42
KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Bệnh nhân bị shock do nhiễm trùng 6
Hình 2: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacsbon. Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans. 8
Hình 3: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm 11
Hình 4: Biểu hiện của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu 14
Hình 5: Cây tỏi 21
Hình 6: Sắc ký đồ của dịch tỏi trước và sau khi sản xuất Allicin từ dịch tỏi. 31
Hình 7: Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tươi 32
Hình 8: Allicin không gây độc đối với tế bào BMDMs 33
Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm 34
Hình 10: Allicin ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bởi zymosan 35
Hình 11: Allicin hay C-K điều hòa quá trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thông qua thụ thể dectin-1. 37
Hình 12: Kết quả thực hiện kỹ thuật Westernt blot 38
Hình 13: Allicin hay C-K ức chế quá trình sản sinh ROS được kích thích bởi zymosan thông qua Dectin-1 39
Hình 14: Allicin bảo vệ chuột nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 40
Hình 15: Allicin ức chế quá trình cytokine tiền viêm trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 41
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1
MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu gần đây đã công bố Allicin: Có khả năng chống viêm nhiễm mạnh, tăng cường hoạt tính của các tế bào trong quá trình thực bào, tăng cường hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, ức chế sự phát triển của những tế bào ung thư [28, 44]. Rất nhiều công bố và các công ty trên thế giới đã sản xuất Allicin từ việc tạo quá trình xúc tác giữa Alliin với enzym allinase có sẵn trong tỏi. Bằng việc sử dụng Allicin chiết xuất từ Alliin có sẵn trong tỏi, các công ty trên thế giới đã sản xuất được rất nhiều loại thực phẩm chức năng cao cấp với nhiều tác dụng sinh học quí.
Dựa vào những tín hiệu của thụ thể Dectin-1, một số hợp chất tách chiết từ thực vật đã được chứng minh có khả năng điều hòa được đáp ứng viêm và điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm khuẩn nặng và choáng nhiễm trùng. Chẳng hạn, các chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đã được công bố có khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phosphoryl hóa MAPK (mitogen activated protein kinase), phản ứng oxy hóa (ROS) thông qua tín hiệu của thụ thể Dectin-1. Tuy nhiên, các chất này có nguồn gốc từ nhân sâm nên rất đắt. Do vậy, việc tìm kiếm các chất có hoạt tính dược học đối với khả năng chống viêm vẫn đang là vấn đề cấp bách để có thể thay thế một số thuốc đang sử dụng hiện nay, cũng như góp phần làm giảm bớt tỷ lệ tử vong và giá thành điều trị của bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng.
Tuy nhiên, kể cả trên thế giới và trong nước chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào đánh giá vai trò của Allicin đối với con đường tín hiệu thụ thể Dectin-1 trong quá trình điều hòa những phản ứng viêm quá mức ở vật chủ. Đặc biệt, Việt Nam là một quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, lượng dân số vào loại cao nhất thế giới nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng do viêm (inflammation) là rất cao. Cho đến nay, thì nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU). Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên cả thế giới. Với thực trạng hiện nay, thị trường trong nước vẫn chủ yếu là thuốc nhập ngoại, giá thành rất đắt và luôn bị phụ thuộc vào các công ty nước ngoài trong khi đó Việt nam lại có một tài nguyên vô cùng đa dạng về thực vật mà khả năng ứng dụng vào dược học là vô cùng phong phú. Ngoài ra việc sử dụng thuốc một cách tự ý đặc biệt là kháng sinh để chống các bệnh nhiễm trùng vẫn đang là một vấn đề cần được giải quyết. Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng. Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tui tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu vai trò của Allicin tách từ tỏi Việt Nam trong quá trình điều hoà đáp ứng viêm thông qua thụ thể Dectin – 1” .
Mục tiêu đề tài
1. Mục tiêu chung
- Đánh giá được 1 phần hoạt tính dược học của Allicin như một loại thuốc trong quá trình điều hóa đáp ứng viêm.
2. Nội dung
- Có qui trình sản xuất Allicin từ tỏi
- Xác định được chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Allicin tổng hợp từ Alliin trong tỏi
- Đánh giá được hiệu quả của Allicin trong quá trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ
Miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng đối với các động vật có xương sống. Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trò như hàng rào bảo vệ đầu tiên nhưng lại không có khả năng nhận dạng lập lại các mầm bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ kháng nguyên bên ngoài xâm nhập vào cơ thể. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu của cơ thể. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu quả mới tham gia vào quá trình viêm cục bộ và bắt đầu những đáp ứng của quá trình miễn dịch đáp ứng. Vô số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh như vi khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống như trên các thụ thể riêng biệt được gọi là PAMP (pathogenic associated molecules pattern). Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng quá trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine, chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng.
1.2. KHÁI NIỆM VIÊM
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi. Khi phản ứng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm nhờ các loại tế bào di chuyển (migrating cells ) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân , các tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian, phần lớn là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1. Các chất này lại tiếp tục hoạt hoá các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein nhờ các proteinase, các interleukin, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô, qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính. Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng. Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do qúa trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [25].
1.3. NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG
Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8]. Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7]. Thời kỳ đầu sẽ biểu hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới quá trình nhiễm trùng. Hầu hết, đó là các cytokine tiền viêm như TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, và interferon gamma (IFN gamma). Sau đó, cơ thể sẽ điều hòa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm (IL-10), các chất ức chế của thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất hoạt của IL-1) [12]. Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ được bắt đầu bằng một số sản phẩm vi khuẩn. Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuẩn gram dương như ngoại độc tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất của vỏ tế bào nấm (zymosan được phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết các thụ thể trên macrophage của vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (NFқB)) [12]. Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15]. Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào. Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng, cùng với quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [25, 21].
Hình 1: Bệnh nhân bị shock do nhiễm trùng
Bé T.T.T.P. (11 tuổi, ngụ tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu) được cấp cứu trong tình trạng shock do nhiễm trùng.
1.4. MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN
Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật. Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của cơ thể có thể cản trở quá trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh. Thứ hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hay phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong. Thứ ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh đó là các mô của tế bào macrophage truyền tín hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô và máu. Quá trình nhận dạng bằng hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau. Hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể xem như có vai trò quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm.
1.4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)
1.4.1.1. Định nghĩa: Thụ thể là những protein biệt hoá để tiếp nhận các phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất).
1.4.1.2. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh
Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được chia làm ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: Thụ thể huyết thanh hay phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hay trong dịch tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19]. Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19]. Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hay gián tiếp (thông qua oposonin) [19]. Đối với In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng ở đa vị trí. Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3), và dectin-1 [20]. Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và chemokine dẫn tới
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Mục tiêu đề tài 3
Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ 4
1.2. KHÁI NIỆM VIÊM 4
1.3. NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG 5
1.4. MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN 7
1.4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) 7
1.4.1.1. Định nghĩa: Thụ thể là những protein biệt hoá để tiếp nhận các phân tử hoá học nội sinh (ligans) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất). 7
1.4.1.2. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh 7
1.4.1.3. Thụ thể Toll- like (TLR) 8
1.4.1.4. Thụ thể Dectin-1 9
1.4.1.5. Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật 10
1.4.1.6. Glucocorticoid 12
1.4.1.7. ROS 12
1.4.1.8. Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm 13
1.5. Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiệm in vivo sử dụng Zymosan 14
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15
1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15
1.6.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) 15
1.6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid 16
1.6.1.3. Các chất khác 16
1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 16
1.7. CÂY TỎI VÀ VAI TRÒ CỦA ALLICIN TRONG QUÁ TRÌNH KHÁNG VIÊM 18
1.7.1. Cây tỏi 18
1.7.1.1. Phân loại thực vật – Đặc điểm sinh thái 19
1.7.2. Allicin và các sản phẩm chứa Allicin 21
1.7.3. Sản xuất Allicin từ alliin có trong tỏi 23
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25
2.1.1. Động vật thí nghiệm 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột 25
2.2.2. Đánh giá hoạt tính độc tố của Allicin tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8 25
2.2.3. Sản xuất Allicin từ tỏi 26
2.2.4. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 27
2.2.4.1. Giới thiệu phương pháp 27
2.2.4.2. Nguyên tắc 27
2.2.4.3. Qui trình thí nghiệm 27
2.2.4.4. Pha dung dịch chuẩn 28
2.2.5. Phân tích hiệu quả ức chế con đường tín hiệu MAPK (p38) của Allicin khi gây viêm bằng zymosan sử dụng kỹ thuật western blot 29
2.2.6. Phân tích ức chế của Allicin trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa 29
2.2.7. Xây dựng mô hình in vivo gây bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trên chuột sử dụng zymosan 29
2.2.8. Phân tích thống kê 30
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Đánh giá khả năng tinh sạch của Allicin 31
3.2. Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tươi 31
3.3. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hửơng bởi Allicin 33
3.4. Đánh giá khả năng zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine 34
3.5. Allicin ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bởi zymosan 35
3.6. Allicin điều hòa quá trình sinh cytokine tiền viêm thông qua thụ thể Dectin-1 36
3.7. Allicin có khả năng ức chế quá trình phospho hóa MAPK (p38 và ERK1/2) trong BMDM được kích thích bởi zymonsan thông qua thụ thể Dectin-1. 38
3.8. Allicin điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1 38
3.9. Allicin bảo vệ chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra bởi zymosan 40
3.10. Allicin đã làm giảm khả năng sản xuất cytokine trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
KẾT LUẬN 42
KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Bệnh nhân bị shock do nhiễm trùng 6
Hình 2: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacsbon. Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1 nhận dạng β-glucans. 8
Hình 3: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm 11
Hình 4: Biểu hiện của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu 14
Hình 5: Cây tỏi 21
Hình 6: Sắc ký đồ của dịch tỏi trước và sau khi sản xuất Allicin từ dịch tỏi. 31
Hình 7: Quy trình sản xuất Allicin từ tỏi tươi 32
Hình 8: Allicin không gây độc đối với tế bào BMDMs 33
Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm 34
Hình 10: Allicin ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bởi zymosan 35
Hình 11: Allicin hay C-K điều hòa quá trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thông qua thụ thể dectin-1. 37
Hình 12: Kết quả thực hiện kỹ thuật Westernt blot 38
Hình 13: Allicin hay C-K ức chế quá trình sản sinh ROS được kích thích bởi zymosan thông qua Dectin-1 39
Hình 14: Allicin bảo vệ chuột nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 40
Hình 15: Allicin ức chế quá trình cytokine tiền viêm trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng 41
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links