MỞ ĐẦU
Vitamin là thành phần không nhiều nhưng lại hết sức quan trọng trong thực phẩm. Nó cần thiết cho sự phát triển, duy trì và thực hiện các hoạt động chức năng của cơ thể con người
Vitamin được tổng hợp chủ yếu trong cơ thể thực vật và vi sinh vật, người và động vật hầu như không thể tự tổng hợp được vitamin. Tuy nhiên cũng có một vài vitamin đặc biệt như :vitamin C được tổng hợp hầu hết cơ thể động vật, vitamin A, D chỉ phát hiện thấy trong cơ thể người ,động vật nhưng không có trong thực vật.
Nhu cầu về vitamin trong cơ thể người rất ít nhưng nhất thiết phải được cung cấp đầy đủ qua thức ăn có nguồn từ động vật, thực vật, vi sinh vật.khi thiếu vitamin người và động vật sẽ mắc bệnh.
Có nhiều vitamin nhưng được chia làm 2 nhóm lớn: vitamin tan trong nước và vitamin tan trong chất béo.
Do vitamin có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nên mỗi loại vitamin có những phản ứng hóa học đặc trưng khác nhau .Người ta sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng đó để định tính và định lượng vitamin
VITAMIN
Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật. Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý.
Các loại vitamin
Vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D1, D2, D3, D4, D5, E, K
Vitamin A, D, E, K hòa tan trong chất béo
Vitamin B, C hòa tan trong nước
Vitamin A
Còn có các tên là retinol, axerophthol...
Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:
Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể.
Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến nhiều dưới tên bêta-caroten. Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamin A để cơ thể có thể sử dụng.
Vitamin A1, A2 được gặp ở trạng thái tự nhiên trong cơ thể động vật:
Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:
Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A. Nó được hấp thụ bởi luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác. Vì vậy sự có mặt của vitamin A là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giác của con người.
Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô sừng, ruột và các con đường hô hấp. Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá.
Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người, nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển cua phôi thai và trẻ em. Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn.
Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ thể, vitamin A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người.
Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do.
Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đến ngăn chặn được một số bệnh ung thư.
Vitamin D
Còn có các tên là antirachitic factor, calcitriol...
Đây là một nhóm hóa chất trong đó về phương diện dinh dưỡng có 2 chất quan trọng là ecgocanxiferon (vitamin D2) và colecanxiferon (vitamin D3). Trong thực vật ecgosterol, dưới tác dụng của ánh nắng sẽ cho ecgocanxiferon. Trong động vật và người có 7-dehydro-cholesterol, dưới tác dụng cửa ánh nắng sẽ cho colecanxiferon.
Vai trò:
Hình thành hệ xương: vitamin này tham gia vào quá trình hấp thụ canxi và photpho ở ruột non, nó còn tham gia vào củng cố, tu sửa xương.
Cốt hóa răng: tham gia vào việc tạo ra độ chắc cho răng của con người.
Chức năng khác: vitamin D còn tham gia vào điều hoà chức năng một số gen. Ngoài ra, còn tham gia một số chức năng bài tiết cảu insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới.
Vitamin E
Vitamin E là một chất chống oxy hoá tốt do cản trở phản ứng xấu của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể.
Vai trò:
Ngăn ngừa lão hoá: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự do mà vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư.
Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tănng sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bênh tim mạch.
Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng việc bảo vệ các tế bào...
Vitamin B1
Còn có các tên là thiamin, aneurin...
Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho các hoạt động chức năng của con người.
Vai trò:
Đồng hoá đường: vitamin B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzym (tham gia vào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoá đường và quá trình phát triển của cơ thể. Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic sẽ tích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh. Vì thế nhu cầu vitamin B1 đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng.
Nhân tố ngon miệng: kích thích sự tạo thành một loại enzyme tham gia vào quá trình đồng hoá thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn.
Sự cân bằng về thần kinh: Vitamin B1 tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền các xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc và trí nhớ.
Vitamin B2
Còn có các tên là riboflavin...
Vitamin B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cần thiết cho quá trình hô hấp (tham gia vào thành phần của các enzyme vận chuyển hiđrô).
Vai trò:
Cân bằng dinh dưỡng: vitamin B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thành năng lượng thông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid,lipid và protein bằng các enzyme.
Nhân tố phát triển
Tình trạng của da
Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất là đối với sự nhìn màu. Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị giác hoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người.
Vitamin C
Còn có các tên là acid ascorbic...
Vitamin C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt động sống quan trọng của cơ thể.
Vai trò:
Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamin C ngăn chặn ảnh hưởng xấu của các gốc tự do, hơn nữa nó có phản ứng tái sinh mà vitamin E - cũng là một chất chống oxy hoá - không có.
Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trưng riêng của viamin C là vai trò quan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đốI với sự tạo thành và bảo vệ các mô như da, sụn, mạch máu, xương và răng.
Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà vitamin C cũng đóng vai trò trong quá trình liền seo.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin E tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm quá trình phát bệnh của một số bênh ung thư.
Tăng cường khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon - chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virut trong tế bào.
Dọn sạch cơ thể: vitamin C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể như thuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra.
Chống lại chứng thiếu máu: vitamin C kích thích sự hấp thụ sắt bởi ruột non. Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu, cho phép làm giảm nguy cơ thiếu máu.
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN
I) Nhóm vitamin tan trong chất béo
1) Các phản ứng của vitamin A (retinol)
a) Phản ứng của vitamin A với H2SO4
Nguyên tắc: khi tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin A bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của lipocrom.
Nguyên liệu và hóa chất: Dầu cá được hòa tan trong clorofooc với tỷ lệ 1/5; H2SO4 đặc.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch vitamin A trong clorofooc và hai giọt H2SO4 đặc. Lắc đều, quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả.
b) Phản ứng của vitamin A với SbCl3
Nguyên tắc: Vitamin A có tác dụng tương hỗ với SbCl3 bão hoà trong chlorofooc, bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu, sau đó có sự biến đổi màu trong ống nghiệm.
Hóa chất: SbCl3 bão hòa trong chlorofooc không ngậm nứơc; dầu cá.
Dụng cụ: ống nghiệm (1), lọ đựng hóa chất (2).
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2 giọt dầu cá và 1ml SbCl3 bão hòa trong chlorofooc. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
c) Phản ứng của vitamin A với FeSO4
Nguyên tắc: Trong môi trường axit, vitamin A tác dụng với FeSO4 tạo thành sản phẩm có màu không ổn định (đối với carotin là tiền của vitamin A tạo thành màu đặc trưng)
Hóa chất và nguyên liệu: FeSO4 bão hòa trong CH3COOH kết tinh, H2SO4(đ), dầu cá tươi.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1ml FeSO4 bão hòa trong CH3COOH và 4 giọt H2SO4(đ) .quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm và giải thích hiện tượng.
2) Phản ứng của vitamin K với anilin
Nguyên tắc: Metinon có cấu trúc tương tự vitamin K1, được tổng hợp nhân tạo, có hoạt tính sinh học cao. Khi metinon tác dụng với anilin tạo thành các hợp chất màu. Phản ứng như sau:
Nguyên liệu và hóa chất: vitamin K 0,2% trong cồn, anilin chưng cất lại.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml vitamin K 0,2% và 10 giọt thuốc thử anilin. Lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả.
3) Các phản ứng của vitamin E (Tocopherol)
a) Phản ứng của vitamin E với FeCl3
Nguyên tắc: Tocopherol tác dụng với FeCl3, bị oxy hóa thành tocopherylquinon. xảy ra phản ứng sau:
Hóa chất: FeCl3 5%, vitamin E 0,1% trong cồn.
Dụng cụ: ống nghiệm, lọ đưng hóa chất.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 10 giọt vitamin E 0,1% và 10 giọt FeCl3 5%, lắc đều. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin E với HNO3
Nguyên tắc: dưới tác dụng của HNO3 đặc, vitamin E bị oxi hóa thành hợp chất kinon
Nguyên liệu và hóa chất:vitamin E( 0.1 %) trong cồn 96 0 ,HNO3(đ)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 10 giọt vitamin E (0.1 %) và 1ml HNO3(đ) lắc nhẹ, để 1 đến 2 phút quan sát và giải thích hiện tượng.
4) Phản ứng của vitamin D (canxipherol)
a) Phản ứng của vitamin D với anilin
Nguyên tắc: trong môi trường axit ,vitamin D tác dụng với anilin,tạo thành hợp chất màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1 ml clorofooc và 4 giọt thuốc thử anilin,lắc đều. trong ống nghiệm xuất hiện các thế nhũ tương có màu. Đun ống nghiệm sôi trong 30 giây, dung dịch biến đổi thành màu đặc trưng.
b) Phản ứng của vitamin D với SbCl3
Nguyên tắc: vitamin D tác dụng với SbCl3 trong clorofooc tạo thành hợp chất màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 1 ml dầu cá tan trong clorofooc. Lắc đều quan sát màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả
c)phản ứng với brome
Khi cho dung dịch Br2/CHCl3 vào dung dịch vitamin thì chất lỏng sẽ có màu xanh.
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 3 giọt dầu cá sau đó thêm giọt dung dịch Br2/CHCl3 .chờ môtl lúc dung dịch xuất hiện màu xanh.
II) Nhóm vitamin tan trong nước.
1) Phản ứng phát huỳnh quang của vitamin B1
a) phản ứng tạo thành thiocrom
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của ferrixianuakali, tiamin bị oxi hóa thành tiocrom. Dưới ánh sáng của tia tử ngoại, tiocrom phát huỳnh quang có màu đặc trưng.phản ứng như sau:
Nguyên liệu và hóa chất: Vitamin B1 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6] 1%, rượu izobutilic.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 20 giọt vitamin B1 1%, 10 giọt NaOH 10% và 5 giọt K3[Fe(CN)6] 1%. Lắc đều cho đến khi dung dịch xuất hiện màu. Thêm vào ống nghiệm 20 giọt rượu izobutilic, lắc đều, sau đó để yên, dung dịch trong ống tạo thành 2 lớp ngăn cách. Để ống nghiệm dưới ánh sáng mặt trời hay dưới ánh đèn tia tử ngoại, quan sát sự tạo thành huỳnh quang, giải thích kết quả.
b) phản ứng AgNO3
Nguyên tắc: Thiamin phản ứng với nitrat Ag để cho kết tủa màu xám.
Tiến hành
ùng 2ml dung dịch vitamin B1 ,axit hóa bằng axit nitric loãng 0.1% và them vào đó 1 ml dung dịch AgNO30.5%, các màng kết tủa xuất hiện.
c) Phản ứng với thuốc thử diazo (hỗn hợp của axit sulfannilic và natri nitric)
Nguyên tắc: vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo sẽ cho màu vàng da cam hay đỏ
Nguyên tắc: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch axit sulfannilic vào 0.5 ml dung dich natri nitric, thêm vào đó vài giọt dung dịch vitamin B1 và 10 giọt carbonat Na 10%.Lắc ống nghiệm ta sẽ thấy màu đỏ da cam
2) Phản ứng của vitamin B6 (Pyridoxin) với FeCl3:
Nguyên tắc: Pyridoxin tác dụng với FeCl3 tạo thành phức chất có màu đặc trưng.phản ứng như sau:
Hóa chất: pyridoxin 1%; FeCl3 5%;
Dụng cụ: ống nghiệm (1); lọ đựng hóa chất (2)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml pyridoxin 1% và 5 giọt FeCl3¬, lắc đều.
Quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả?
3) Các phản ứng của vitamin C
a). Phản ứng của vitamin C với ferrixianuakali (K3[Fe(CN)6])
Nguyên tắc: Vitamin C có 2 nhóm enol linh động dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hoá khử với một số chất như: ferrixianuakali; 2,6 – diclorophenol indolphenol, iot.phản ứng xảy ra như sau:
Hóa chất: K3[Fe(CN)6] 5%; FeCl3 5%; axit ascorbic 1%.
Dụng cụ: ống nghiệm , lọ đựng hóa chất .
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml axit ascorbic 1%, 1ml K3[Fe(CN)6] 5% và 3 giọt FeCl3 5%, lắc nhẹ. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin C với 2,6-diclorophenol indophenol (2,6D)
2,6D trong môi trường kiềm có màu xanh, trong môi trường axit có màu hồng, khi tác dụng với vitamin C, phản ứng oxi hóa –khử diễn ra như sau:
Hóa chất:axit ascorrbic 1%, 2,6D 0.01%; HCl 2%
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 20 giọt 2,6D 0.01% và 2 giọt HCl 2%dung dịch xuất hiện màu.sau đó cho 10 giọt
B) ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
I)Xác định Vitamin A trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chuẩn bị dụng cụ:
- Hệ thống máy HPLC, Shimadzu
- Cột Purospher Star RP-18e( 150x4.6mm,5um)
- Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg
- bộ chưng cất có ống sinhhàn hồi lưu
- bình định mức 10ml
- pipet các loại : 0.1ml, 0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,...
- ống Hatch
- công cụ thủy tinh các loại: Becher, erlen.
Chuẩn bị hóa chất:
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích , gồm:
- nước cất loại dùng cho HPLC
- Dietyl ete tinh khiết không có Peroxit
- Etanol
- Dung dịch Kalihydroxyde( KOH) 2M trong cồn : hòa tan 11.2g KOH trong 100ml cồn 96o
- Dung dịch Kalihydroxyde ( KOH) 2% trong nước : Hòa tan 2g KOH trong 100ml nước cất
- Acetonnitrile, HPLC
- Na2SO4 khan.
Cách tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Nếu dùng chuẩn vitamin A thì phân tích ngay trên thiết bị HPLC. Nếu Dùng vitamin A dưới dạng este, thí dụ như vitamin A acetat, vitamin A palmitat,...thì phải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A ra thể tự do rồi mới tiến hành phân tích bằng HPLC.
Xây dựng đường chuẩn dùng Vitamin A palmitat
Quá trình xà phòng hóa:
Cân 18.32 mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A ( phân tử lượng của Vitamin A là 286, phân tử lượng của vitamin A Palmitat là 524) cho vào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M trong etanol và 0.5natri ascorbat. lắp ống sinh hàn hồi lưu . Đặt trên nồi cách thủy, xà phòng hóa ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút.
Chuyển dung dịch còn nóng vào một bình lóng, rửa bình cầu nhiều lần bằng H2O cất và tập trung nước rửa vào bình lóng.
Chú ý: lượng nước không được quá 3 lầnlượng KOH 2M để tránh hình thành nhủ tương có thể gây mất Vitamin A khi chiết.
Vitamin A từ dung dịch đã xà phòng hóa được chiết 3 lần bằng dietyl ete không có peroxit 3 lần, mỗi lần 40ml. Tập trung lớp ete chiết được vào một bình lóng. Rửa lớp ete nhiều lần với nước cất (mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm (thử với phenolphtalein). Loại nước trong dịch chiết etebằng cách lọc qua lớp Na2SO4 khan, rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lốp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan trong acetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml. Định mức đến vạch bằng acetonitrile. Dung dịch này dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc (1000mg/l)
Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút chính xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn gốc 1000ug/ml vào bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng ACN.
Chuẩn bị mẫu thử :
Cân khoảng 10g mẫu thử đã được nghiền nhỏ ( nếu cần) cho vào bình cầu thuỷ tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hoá như đã ghi ở phần trên.
Sau khi rửa dịch chiết ete bằng 15ml KOH 2% và nhiều lần với nước cất ( mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm ( thử với phenoltalein) . Loại nước trong dung dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp NaSO4 khan , rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn . Hoà tan phần còn lại bằng chính xác 1ml dung dịch pha động ( vortex 15giây và siêu âm 3 phút) . Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0.45um và thu dịch lọc và tiến hành phân tích trên HPLC.
Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi:
Cho thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10ng/ml vào 10g mẫu trắng . đồng nhất mẫu bằng chách siêu âm khoảng 1 phút. tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử.
Tiến hành phân tích trên HPLC:
Điều kiện phân tích :
- pha động
- tốc độ dòng
- detector UV, λ= 325nm
tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự sau:
- Các dịch chuẩn . Dựng đừơng chuẩn giữa nồng độ các chuẩn vitamin A và diện tích của các chuẩn Vitamin A. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính.
- Dung dịch mẫu trắng
- Dung dịch mẫu kiểm soát. tính hàm lượng các vitamin A trong dịch chiết. và trong mẫu thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên .Tính độ thu hồi mẫu kiểm soát (R).
- Các dung dịch mẫu thử nghiệm. tính hàm lượng vitamin A trong dịch chiết ( Co ) thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên.
Tinh kết quả:
Hàm lượng vitamin A có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C = Co/m
Trong đó:
- C là hàm lượng Vitamin A có trong mẫu Tính theo mg/Kg
- Co là hàm lượng Vatamin A trong dịch chiết.( Co) thông qua đường chuẩn, mg/L
- m : Khối lượng (g
II.Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ
1)Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP
a)Nguyên tắc:
Vitamin C (axit ascorbic) hòa tan trong nước, dễ bị phân hủy dưới tác dụng của các chất oxi hóa và bền trong môi trường axit. Vì vậy người ta thường chiết axit ascorbic của mẫu phân tích bằng các dung dịch axit như axit axetic 5%, axit metaphôtphoric 2%.
Phương pháp dựa trên nguyên tắc axit ascorbic có khả năng oxi hóa khử thuận nghịch chất chỉ thị 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP. Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu tốn tính ra lượng axit ascorbic có trong mẫu phân tích. Phản ứng xẩy ra như sau:
Chất chỉ thị này có khả năng chuyển màu khi PH của môi trường thay đổi từ kiềm sang axit, có màu tím trong khoảng PH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở PH < 4.
b)Hóa chất :
- Dung dịch HCl 1% và CH3COOH 5%.
- Dung dịch axit metaphosphoric (HPO3) 2% hay axit axetic 1%.
- Dung dịch amoni oxalate (C2H8N2O4) bão hòa.
- Tinh thể KI.
- Dung dịch H2SO4 2%.
- axit ascorbic (Vitamin C) tinh khiết ( bảo quản kín trong lọ màu tối).
- Dung dịch hồ tinh bột 1%.
- Dung dịch thuốc chỉ thị DPIP 0.001N: cân 0.15g DPIP cho vào bình định mức dung tích 500 ml, them 350ml nước cất, cho tiếp dung dịch đệm phôtphat PH = 6,9 đến 7,0 đến vạch mức. vì trong nước, thuốc thử bị phá hủy nhanh nên được pha với dung dịch đệm. Thuốc thử DPIP được bảo quản trong bình có màu ở nơi tối ( không quá 7 ngày).
- Dung dịch đệm phosphate PH = 6.9 đến 7,0: trộn 2 thể tích KH2PO4 (9,075 gam KH2PO4 trong 1 lit nước cất) và 3 thể tích Na2HPO4 (11,867 gam Na2HPO4 .2H2O trong 1 lit nước cất) với nhau trước khi đem dùng.
c)Tiến hành:
1. Cân 10 đến 50 g rau tươi hay 5 đến 10 g sản phẩm đóng hộp, tùy theo hàm lượng Vitamin C có trong từng lọ nguyên liệu. Cho mẫu vào cối sứ.
2. Cho thêm 4,5 ml HCl 1% (hay CH3COOH 5%) vào cối (ngập kín mẫu). Khi lấy mẫu tránh dung công cụ bằng sắt hay đồng. Nghiền mẫu không quá 10 phút.
3. Cho dịch nghiền vào bình định mức 100 ml. Cho thêm 25 ml axit metaphosphoric 2% ( hay chì axetat 5%) để loại bỏ protein. Lắc đều, tiếp tục cho thêm HCl 1% (hay axit oxalic 1%) để tráng cối và thêm đến vạch mức.
Khi thí nghiệm với các mẫu động vật thì dùng axit tricloaxetic (CCl3COOH) 20%, sao cho nồng độ của nó đạt 5% trong dung dịch (25 ml). Trong trường hợp không có axit metaphosphoric (HPO3) hay oxalic (C2H¬2O4) có thể dùng HCl 1% hay CH3COOH 5%. Lắc và để yên 10 phút, lọc.
4. Dùng pipet lấy 5 ml dịch chiết lọc cho vào bình nón 50 ml, thêm 5 ml dung dịch amoni oxalate bão hòa, 10 ml nước cất và chuẩn độ bằng dung dịch DPIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền ( không mất màu trong 10 phút). Trong truờng hợp dùng axit oxalic thì không cẩn cho thêm amoni oxalate nữa.
Song song làm thí nghiệm kiểm tra với các hóa chất sử dụng.
Chú ý: Khi xác định Vitamin C trong mẫu thí nghiệm phải phân tích ít nhất 2 mẫu, mỗi mẫu 3 bình thí nghiệm. Kết quả chuẩn độ 2 lần không sai khác quá 0,03 ml DPIP 0,001N.
Thời gian chuẩn độ không quá 2 phút và lượng thuốc thử DPIP dung để chuẩn độ khoảng từ 1 đến 2 ml (không quá 2 ml hay ít hơn 1 ml).
d)Tính kết quả:
Hàm lượng Vitamin C (mg %) tính theo công thức
Trong đó: a – Số ml dung dịch DPIP 0,001N dung chuẩn độ bình thí nghiệm,
b – Số ml dụng dịch DPIP 0,001N dung chuẩn độ ở bình kiểm tra,
f – hệ số dung dịch chuẩn,
V – Thể tích dịch chiết Vitamin C (ml),
w – khối lượng mẫu thí nghiêm (g).
Xác định hệ số f : hòa tan 1 đến 1,5 mg axit ascorbic vào 50 ml H2SO4 2%. Lấy 5 ml dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch DPIP 0,001N cho đến màu hồng bền. lấy vào bình định mức khác 5 ml dung dịch axit ascorbic trên, thêm một ít tinh thể KI (3 – 5 mg) và 5 giọt hồ tinh bột 1%. Chuẩn độ bằng dung dịch KIO3 0,001N cho đến khi xuất hiện màu xanh. Hệ số f được tính theo công thức:
Trong đó: 0,088 – số mg axit ascorbic ứng với 1ml dung dịc KIO3 0,001N (giống với 1ml dung dịch DPIP 0,001N).
a – số ml dung dịch KIO3 0,001N dùng để chuẩn độ 5 ml dung dịch axit ascorbic.
b – số ml dung dịch DPIP 0,001N để chuẩn độ 5 ml dung dịch axit ascorbic.
2) Phương pháp sử dụng iot:
a) Nguyên tắc:
Vitamin C có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi Vitamin C có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitaminC.
b) Hóa chất:
- Dung dịch HCl 5%.
- Dung dịch 0,01N.
- Dung dịch tinh bột 1%.
c) Tiến hành:
Cân 5 gam lá thì là tươi nghiền nhỏ trong cối sứ với 5 ml HCl 5%, nghiền kĩ, cho vào ống đong (hay bình định mức), dẫn đến vạch 50 ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20 ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100 ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh.
d)Tính kết quả:
Hàm lượng Vitamin C được tính theo công thức sau:
Trong đó: V – số ml dung dịch iot 0.01N dùn chuẩn độ
V1- thể tích dịch mẫu thí nghiệm (50ml)
V2- thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml)
w- khối lượng mẫu(g)
0.00088- số gam vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iot 0.01N
III. địng lượng vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang.
Sự phát quiang có thể được hiểu là năng lượng được tách ra khi các nguyên tử kích thích bởi các chùm sáng có bước song tới hạn, tương tự như hiện tượng lân quang. Tuy nhiên sự khác nhau,giữa hai hiện tượng này là phát huỳnh quang giải phóng ngay lập tức năng lượng ánh sáng hấp thụ từ một nguyên tử hay phân tử, còn lân quang giải phóng từ năng lượng hấp thụ. Cả hai đều là sự phát quang.
Rất nhiều hợp chất giàu e, như hợp chấy chứa hai hay nhiều nối đôi liên hợp và do có ∏-electron nên phát huỳnh quang.
Các e của một phân tử tồn tại trong điều kiện năng lượng thấp nhất (mức năng l ượng thấp nhất của trạng thái cơ bản)vì các e này không ổn định trong bất cứ một bậc năng lượng nào khác. Trạng thái cơ bản này là trạng thái năng lượng bình thường của một phân tử. nếu như phân tử này bị chiếu bởi bức xạ tử ngoại và nó hấp thụ một số proton thì phân tử này sẽ bị kích thíchđén một trạng thái năng lượng cao hơn. Hiện tượng này cũng giống như hiện tượng đã xảy ra khi một e hay các e thu năng lượng và nhảy từ trạng thái năng lượng cơ bản đến mức năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đầu tiên.
Theo lí thuyết lượng tử thì mức năng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một số trạng thái xác định ,cho nên chỉ có ánh sáng với những tần số tương ứng với năng lượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ. Bởi vì một trong rất nhiều trạng thái kích thích có thể được hình thành, nên các hợp chất có thể hấp thụ ánh sáng với các tần ssó khác nhau.
Quá trình hấp thụ xảy ra rất nhanh khoảng 10-15 giây. Electron se duy trì ở trạng thái kích thích từ 10-8 ddeens 10-4 giây. Sau đó nó sẽ bắt đàu nhảyvề trạng thái cơ bản. quá trình này có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng tỏa ra dưới dạng nhiêựt hay e rơi xuống mức dao động thấp nhất của trạng thái cơ bản ,đồng thời giải phóng một photon năng lượng và phát huỳnh quang. Do một lượng năng lượng dã bị mất trước khi e nhảy xuống trạng thái năng lượng thấp hơn ,nên năng lượng giải phóng dưới dạng photon phải có ít năng lượng hơn photon kích thích
Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát. Nhiều hợp chất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnh quang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,N hay S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên. Tuy nhiên một số nhóm có thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điều trên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khác nhau. Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phát quang tại cùng một bước sóng .sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợp chất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính. Nếu có sự nghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữ liệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này.
Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quá trình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước. không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụ cùng một bước sóng kích thích khác. Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hay thay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó.
Phép đo huỳnh quang cũng có thể được dùng trong phân tich dịnh lượng vì cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của hợp chất phát quang. Tuy nhiên mối liên quan trực tiếp này chỉ đúng với dung dịch rất loãng vì ánh sáng phát ra từ những chất phát quang đều phải di qua dung dịch trước khi đến máy đo quang vì thế một lượng ánh sáng sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử khác trong dung dịch. Nồng độ càng cao thì lượng ánh sáng phát xạ bị hấp thụ càng lớn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tăng tiến tới bão hòa và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lí do này mà đường chuẩn như vậy thường được dùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang ). Do đó một giá trị của cường độ huỳnh quang có thể sẽ tương ứng với hai giá trị nồng độ của chất phát quang.
Chất tan có ảnh hưởng đến tính chất phát huỳnh quang của một hợp chất. những chất tan khác nhau có thể làm tăng hay giảm cường độ phát quang. Cũng như vậy hằng số điện môi thể hiện mức độ phát quang tự do của các điện tử л và do đó thể hiện sự thay đổi bước sóng cực đại huỳnh quang. Dung dịch đệm có xu hướng gây ảnh hưởng dập tắt bước sóng của một số chất và ảnh hưởng này tăng khi dung dịch đệm tăng lên.
Cường độ phát huỳnh quang của một hợp chất dễ bị ion hóa sẽ thay đổi theo trạng thái ion hóa mà quá trình ion hóa này lại phụ thuộc độ PH. Nhiều hợp chất sinh học có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên hay pháy huỳnh quang hóa học dễ bị ion hóa, cường độ phát huỳnh quang của những chất này phụ thuộc vào PH. Một số hợp chất bị ion hóa bởi ánh sáng và do đó phát huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ càng cao thì tốc độ chuyển động của các phân tử trong dung dịch càng tăng. Do đó năng lượng hấp thụ chuyển thành nhiệt chứ không phải là huỳnh quang.
Với một số chất không bền trong dung dịch ,tốc độ phân hủy quang phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Phần lớn các chất phát huỳnh quang phân hủy thành các chất không phát huỳnh quang. Tuy nhiên một số phân hủy thành chất có độ huỳnh quang thậm chí còn cao hơn chất ban đầu.
Phần lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mở được ở ghiữa nguồn sáng và mẫu thí nghiệm, khe này được mở ngay trước khi đo để giảm tối thiểu sự phân hủy quang.
Sự dập tắt xảy ra khi sự phat huỳnh quang của một chất bị giảm bởi một chất khác. Có hai loại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật. ảnh hưởng màng lọc xảy ra khi màng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hay ánh sáng phát xạ. còn sự dập tắt thật thì xảy ra khi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biến thành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dập tắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang. Có thể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trong dung dịch. Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi.
Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và độ nhạy. tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so với phương pháp quang phổ hấp thụ.
Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bước sóng của ánh sang kích thích. Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứn ánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,cho nên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp. trong các kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác, do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau.
Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:
- Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ
- Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ không phải là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ.
Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàm lượng vitamin B2.
1.Nguyên tắc:
Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B2) là chất có màu vàng-xanh lá cây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang .riboflavin có nhiều trong tế bào động vật và thực vật. nó bền trong muối khoáng và phần lớn các tác nhân oxi hóa ,nhưng lại không bền trong dung dịch kiềm.nó rất nhạy cảm với tia khả kiến và tia tử ngoại nên các thap tác được thực hiện trong ánh sáng dịu hay trong các công cụ thí nghiệm thủy tinh có độ quang hóa thấp
Trong các tế bào sống ,riboflavin thừờng kết hợp với axit photphorichoawcj cả với axit adenylic (FMN hay FAD). Cả 2 đều có thể kết hợp một số protein đặc thù để hình thành các enzyme oxi hóa. Trong một số sản phẩm ( sữa), riboflavin tồn tại dưới dạng tự do có thể thẩm tách cũng như dạng coenzyme.
Trong phần lớn các quy trình riboflavin, cần thiết phải xử lý các sản phẩm tự nhiên với axit hay enzyme để thu được giá trị tối đa. Bước xử lý này giải phóng riboflavin khỏi phức chất protein và giúp cho việc tách chiết dễ dàng hơn.
Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ quét tự vi. Dùng máy quang phổ huỳnh quang quét có điều khiển để điều chỉnh sự phát huỳnh quang của riboflavin khi có mặt những chất gây cản trở, những chất này theo lý thuyết có ảnh hưởng đến các chất chuẩn và mẫu thí nghiệm. Do đó cường độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ của riboflavin trong dung dịch loãng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênh lệch độ huỳnh quang trước và sau sự khử Natritiosunfit (Na2S2O4 ).
2) Tiến hành
a) Quy trình thí nghiệm tách chiết
1.cân 6.0 g ngũ cốc (dự tính là chứa 5 đến 10 microgam riboflavin), nghiền bằng cối sứ.
2.đổ vào bình nón 100 ml và them 50 ml dung dịch HCl 0.01M. lức bình để tẩm ươt hết ngũ cốc. sau đó đậy nắp bình bằng giấy nhôm (tốt nhất là giấy bạc) để tránh riboflavin bị phân hủy bởi ánh sáng. Đặt trong nồi cách thủy đang đun sôi khoảng 1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần. kiểm tra mức nước mỗi lần lắc bình, không để nước cạn.
3.Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnh đến 6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)
Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin.
4.Ngay lập tức them HCl 1M để giảm PH đến 4.5.li tâm bằng ống li tâm thủy tinh 100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút.
5.Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức.
b) Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết
1.Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằng máy trộn.
2.Lấy 2ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩn riboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều.
3.Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút.
4.Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO4 3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút.
5.Cho 0.5 ml H2O2 3% vào mỗi ống và trộn đều. màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10 giây.
c) Đo độ huỳnh quang của dịch chiết
1.Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thích phải được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer).
2.Xác định cực đại của bước sóng phát xạ và bước sóng kích thích của dung dịch chuẩn riboflavin (nồng độ 1 microgam/ml riboflavin) giá trị cực đại cho kích thích nên có giá trị là 450 nm. Giá trị cực đại cho phát xạ là 530nm.
F =2.303.Ф.p0.έ.b.c
Trong đó: Ф –hiệu suất lượng tử
P0 –cường độ tối
έ – độ hấp thụ phân tử
b –độ dài đường dẫn
c – nồng độ
Phương trình này chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ thấp. ở phương trình trên,cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với cường độ tối p0 và nồng độ c. độ huỳnh quang sẽ tăng khi p0 tăng (hay công suất của nguồn tăng), độ huỳnh quang cũng tăng khi nồng độ của chất phát quang tăng.
Để thành lập mối lien quan theo định luật Lambert-Beer, có một đường chuẩn độ cho riboflavin chứa 0.5 – 1.0 – 2.0 và 4.0 microgam/ml.
Chú ý: Trong khi đo huỳnh quang, phải để cẩn thận tránh không cho dung dịch tiếp xúc với tia tử ngoại quá lâu nếu không sẽ làm riboflavin bị phân hủy rất nhanh.
3.Đo độ huỳnh quang của dịch chiết không chứa riboflavin (kết quả A). dung 3ml dung dịch trong cuvett.
4.Cho vào cuvett đã chứa 3 ml dịch chiết này khoảng 5mg Na2S2O4 (pha trong nước) trộn đều và đo ngay lập tức (kết quả C)
5.Đo độ huỳnh quang của dịch chiết có chứa riboflavin thêm vào (kết quả B).
3) Tính kết quả
Tính lượng riboflavin có trong ngũ cốc bằng công thức sau:
4) Báo cáo thí nghiệm
1. vẽ một đường chuẩn để thành lập mối liên hệ theo định luật Lambert-Beer cho riboflavin, dung dung dịch riboflavin chuẩn 0.5;1.0;2.0 và 4 micrôgam/ml.
2.So sánh kết quả thu được với giá trị như trên vỏ hộp (đã được xác định bởi nhà sản xuất).
3.Vẽ cấu tạo hóa học của riboflavin và chỉ ra bản chất của những phần phát huỳnh quang.
4.Sự tăng lượng tử của một chất ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang như thế nào?
IV. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang
1)Nguyên tắc
Khi oxi hóa vitamin B1(thiamin) bằng kali feroxianua trong môi trường kiềm sẽ tạo thành hợp chất thiochom,chất này có màu huỳnh quang xanh dưới ánh sáng tử ngoại.Cứ một phân tử thiamin sẽ tạo thành một phân tử thiocrom.
Để xác định hàm lượng thiamin, người ta dùng dung dịch chuẩn thiamin tinh khiết so sánh với dung dịch nghên cứu. trước khi tiến hành các phản ứng, thiamin phải được giải phóng ra khỏi mẫu bằng chế phẩm enzim photphataza , papayolin ,hay takađiataza.
2)Hóa chất
-Dung dịch H2SO4 0.1N.
-Dung dịch CH3COOH 30%.
-Dung dịch NaOH 15%.
-Dung dịch kaliferoxianua [K3Fe(CN)6] 1%chẩn bị để dùng trong ngày và giữ trong lo mầu.
-Rượu butylic (C4H9OH) hay isoamylic [(CH3)2CH(CH2)2OH]: các rượu này không được phát huỳnh quang. Nếu phát huỳnh quang phải khử bằng than hoạt tính(15 g than cho vào 1 ml rượu): rượu trộ với than lắc 30 phút trên máy lắc ,lọc làm khan bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp.
-Chế phẩm photphataza của khuẩn ti penicillium: khẩn này được sấy khô ở nhiệt độ 400c. lấy 10 mg khuẩn này nghiền với 1ml dung dịch natri axetat 30%, chuyển vào bình định mức, thêm natri axetat đến PH=5.
-Dung dịch vitamin B1 chuẩn
+Dung dịch gốc(a): 10mg thiamim tinh thể hòa tan vào 10ml HCl 0.01N.Chuyển dung dịch vào bình định mức dung tích 100ml.Thêm cất đến vạch,lắc kỹ.Đựng trong chai màu nâu,để ở chổ mát có thể dữ được một tháng.Cứ 1ml dung dịch này chứ 100γ –thiamim.Lấy 1ml dung dịch này cho vào bình dịnh mức dung tích 100ml,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,1ml dung dịch này chứa 1 γ thiamim.
+ Dãy dung dịch thiamim chuẩn(b):từ dung dịch trên cho vào các ống nghiệm lần lượt 0.5;1.0;1.5;2ml(chứa 0.5;1.0;1.5;2 γ thiamim ),thêm vào các ông nghiệp lần lượt 4.5;4.0;3.5;3.0ml nước cất và 1ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% (mới pha).Cuối cùng cho vào mỗi ống 3ml dung dịch NaOH 1%.Lắc nhanh,mỗi ống lại cho thêm 10ml rượu butylic,lắc.Để yên 10 phút ,dung dịch sẽ tách thành 2 lớp.Li tâm ,tách bơ lớp dưới,cho vào 1g Na¬2¬SO4 khan.Dung dịch rượu khan chứa thiỏcom được cho vào dãy ống nghiệp khác.Ta được dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2-3 ngày.
3)Tiến hành:
1.Cân 5-10g mẫu, nghiền trong cối sứ với 10-15ml H2SO4 0.1N.Chuyển vào bình định mức cỡ 100ml,thêm H2SO4 đến 75ml.
2.Đặt bình vào nồi cách thủy sôi trong 45 phút ,lắc điều, để nguội vào thêm chế phẩm photphataza vào( cứ 1g mãu cần 0.03g khuẩn ti khô)bằng cách:cân khuẩn ti,đem nghiền trong cối với 2-3ml natri axetat 30% rồi chuyển vào bình định mức, thêm natri axetat đến pH=5.
3.Đặt bình vào máy ổn nhiệt ở 40oC trong 12 giờ.Sau đó lấy bình ra,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,lọc.
4.Hút lấy 5ml nước lọc cho vào phiễu chiết,thêm 10ml rượu butylic,lắc mạnh 1-2 phút ,chiết tách bỏ lớp rượu .Thêm vào 1ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 3ml NaOH 15% ,lắc nhanh và thêm 10ml rượu butylic.Lắc,tách bỏ lớp nước.Lọc lớp rượu qua giấy lọc chứa NaOH khan.Chuyển dung dịch vào ống nghiệm.
5.Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thí nghiệm so với dãy dung dịch thiamim chuẩn trên máy quang phổ dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh,thủy ngân TIK-4,kính lọc màu đen(kích thước là 432ml nm,sự phát xạ là 545nm).
4)Tính kết quả:
Hàm lượng vitamim B1(mg%)được tính theo công thứ sau:
Trong đó:
a- lượng vitamim có trong ống nghiệm chuẩn có màu huỳnh quang trùng với mẫu ống nghiệm (γ).
V-dung tích bình định mức(ml).
V1- thể tích dung dịch thí nghiệm lấy để oxi hóa(ml).
w- khối lượng mẫu(g).
1000-chuyển từ γ ra mg.
V.Chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng Vitamin D ( D2 và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC
Nguyên tắc: Xác định vitamin D (D2 and D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Để chuẩn hoá phương pháp này phù hợp với phòng thí nghiệm chúng tui đã tiến hành khảo sát và phân tích bằng HPLC của hãng Finnigan. Mẫu được xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxit trong môi trường ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở nhiệt độ 75oC trong 1 giờ. Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin D) được chiết bằng ete dầu hoả và làm sạch qua cột SPE. Bơm dung dịch rửa giải thu được vào hệ thống sắc ký và xác định vitamin D định bằng detector DAD ở bước sóng 265nm. Kết quả thu được cho giới hạn phát hiện của vitamin D2 và D3 là 2,2 và 3,4ppb; giới hạn định lượng tương ứng là 7 và 11ppb; độ thu hồi của vitamin D đạt 75-90 %.
Link download bản doc:
Vitamin là thành phần không nhiều nhưng lại hết sức quan trọng trong thực phẩm. Nó cần thiết cho sự phát triển, duy trì và thực hiện các hoạt động chức năng của cơ thể con người
Vitamin được tổng hợp chủ yếu trong cơ thể thực vật và vi sinh vật, người và động vật hầu như không thể tự tổng hợp được vitamin. Tuy nhiên cũng có một vài vitamin đặc biệt như :vitamin C được tổng hợp hầu hết cơ thể động vật, vitamin A, D chỉ phát hiện thấy trong cơ thể người ,động vật nhưng không có trong thực vật.
Nhu cầu về vitamin trong cơ thể người rất ít nhưng nhất thiết phải được cung cấp đầy đủ qua thức ăn có nguồn từ động vật, thực vật, vi sinh vật.khi thiếu vitamin người và động vật sẽ mắc bệnh.
Có nhiều vitamin nhưng được chia làm 2 nhóm lớn: vitamin tan trong nước và vitamin tan trong chất béo.
Do vitamin có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nên mỗi loại vitamin có những phản ứng hóa học đặc trưng khác nhau .Người ta sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng đó để định tính và định lượng vitamin
VITAMIN
Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật. Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý.
Các loại vitamin
Vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D1, D2, D3, D4, D5, E, K
Vitamin A, D, E, K hòa tan trong chất béo
Vitamin B, C hòa tan trong nước
Vitamin A
Còn có các tên là retinol, axerophthol...
Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:
Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể.
Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến nhiều dưới tên bêta-caroten. Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamin A để cơ thể có thể sử dụng.
Vitamin A1, A2 được gặp ở trạng thái tự nhiên trong cơ thể động vật:
Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:
Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A. Nó được hấp thụ bởi luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác. Vì vậy sự có mặt của vitamin A là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giác của con người.
Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô sừng, ruột và các con đường hô hấp. Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá.
Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người, nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển cua phôi thai và trẻ em. Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn.
Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ thể, vitamin A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người.
Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do.
Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đến ngăn chặn được một số bệnh ung thư.
Vitamin D
Còn có các tên là antirachitic factor, calcitriol...
Đây là một nhóm hóa chất trong đó về phương diện dinh dưỡng có 2 chất quan trọng là ecgocanxiferon (vitamin D2) và colecanxiferon (vitamin D3). Trong thực vật ecgosterol, dưới tác dụng của ánh nắng sẽ cho ecgocanxiferon. Trong động vật và người có 7-dehydro-cholesterol, dưới tác dụng cửa ánh nắng sẽ cho colecanxiferon.
Vai trò:
Hình thành hệ xương: vitamin này tham gia vào quá trình hấp thụ canxi và photpho ở ruột non, nó còn tham gia vào củng cố, tu sửa xương.
Cốt hóa răng: tham gia vào việc tạo ra độ chắc cho răng của con người.
Chức năng khác: vitamin D còn tham gia vào điều hoà chức năng một số gen. Ngoài ra, còn tham gia một số chức năng bài tiết cảu insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới.
Vitamin E
Vitamin E là một chất chống oxy hoá tốt do cản trở phản ứng xấu của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể.
Vai trò:
Ngăn ngừa lão hoá: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự do mà vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư.
Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tănng sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bênh tim mạch.
Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng việc bảo vệ các tế bào...
Vitamin B1
Còn có các tên là thiamin, aneurin...
Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho các hoạt động chức năng của con người.
Vai trò:
Đồng hoá đường: vitamin B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzym (tham gia vào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoá đường và quá trình phát triển của cơ thể. Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic sẽ tích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh. Vì thế nhu cầu vitamin B1 đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng.
Nhân tố ngon miệng: kích thích sự tạo thành một loại enzyme tham gia vào quá trình đồng hoá thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn.
Sự cân bằng về thần kinh: Vitamin B1 tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền các xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc và trí nhớ.
Vitamin B2
Còn có các tên là riboflavin...
Vitamin B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cần thiết cho quá trình hô hấp (tham gia vào thành phần của các enzyme vận chuyển hiđrô).
Vai trò:
Cân bằng dinh dưỡng: vitamin B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thành năng lượng thông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid,lipid và protein bằng các enzyme.
Nhân tố phát triển
Tình trạng của da
Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất là đối với sự nhìn màu. Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị giác hoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người.
Vitamin C
Còn có các tên là acid ascorbic...
Vitamin C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt động sống quan trọng của cơ thể.
Vai trò:
Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamin C ngăn chặn ảnh hưởng xấu của các gốc tự do, hơn nữa nó có phản ứng tái sinh mà vitamin E - cũng là một chất chống oxy hoá - không có.
Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trưng riêng của viamin C là vai trò quan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đốI với sự tạo thành và bảo vệ các mô như da, sụn, mạch máu, xương và răng.
Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà vitamin C cũng đóng vai trò trong quá trình liền seo.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin E tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm quá trình phát bệnh của một số bênh ung thư.
Tăng cường khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon - chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virut trong tế bào.
Dọn sạch cơ thể: vitamin C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể như thuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra.
Chống lại chứng thiếu máu: vitamin C kích thích sự hấp thụ sắt bởi ruột non. Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu, cho phép làm giảm nguy cơ thiếu máu.
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN
I) Nhóm vitamin tan trong chất béo
1) Các phản ứng của vitamin A (retinol)
a) Phản ứng của vitamin A với H2SO4
Nguyên tắc: khi tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin A bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của lipocrom.
Nguyên liệu và hóa chất: Dầu cá được hòa tan trong clorofooc với tỷ lệ 1/5; H2SO4 đặc.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch vitamin A trong clorofooc và hai giọt H2SO4 đặc. Lắc đều, quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả.
b) Phản ứng của vitamin A với SbCl3
Nguyên tắc: Vitamin A có tác dụng tương hỗ với SbCl3 bão hoà trong chlorofooc, bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu, sau đó có sự biến đổi màu trong ống nghiệm.
Hóa chất: SbCl3 bão hòa trong chlorofooc không ngậm nứơc; dầu cá.
Dụng cụ: ống nghiệm (1), lọ đựng hóa chất (2).
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2 giọt dầu cá và 1ml SbCl3 bão hòa trong chlorofooc. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
c) Phản ứng của vitamin A với FeSO4
Nguyên tắc: Trong môi trường axit, vitamin A tác dụng với FeSO4 tạo thành sản phẩm có màu không ổn định (đối với carotin là tiền của vitamin A tạo thành màu đặc trưng)
Hóa chất và nguyên liệu: FeSO4 bão hòa trong CH3COOH kết tinh, H2SO4(đ), dầu cá tươi.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1ml FeSO4 bão hòa trong CH3COOH và 4 giọt H2SO4(đ) .quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm và giải thích hiện tượng.
2) Phản ứng của vitamin K với anilin
Nguyên tắc: Metinon có cấu trúc tương tự vitamin K1, được tổng hợp nhân tạo, có hoạt tính sinh học cao. Khi metinon tác dụng với anilin tạo thành các hợp chất màu. Phản ứng như sau:
Nguyên liệu và hóa chất: vitamin K 0,2% trong cồn, anilin chưng cất lại.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml vitamin K 0,2% và 10 giọt thuốc thử anilin. Lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả.
3) Các phản ứng của vitamin E (Tocopherol)
a) Phản ứng của vitamin E với FeCl3
Nguyên tắc: Tocopherol tác dụng với FeCl3, bị oxy hóa thành tocopherylquinon. xảy ra phản ứng sau:
Hóa chất: FeCl3 5%, vitamin E 0,1% trong cồn.
Dụng cụ: ống nghiệm, lọ đưng hóa chất.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 10 giọt vitamin E 0,1% và 10 giọt FeCl3 5%, lắc đều. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin E với HNO3
Nguyên tắc: dưới tác dụng của HNO3 đặc, vitamin E bị oxi hóa thành hợp chất kinon
Nguyên liệu và hóa chất:vitamin E( 0.1 %) trong cồn 96 0 ,HNO3(đ)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 10 giọt vitamin E (0.1 %) và 1ml HNO3(đ) lắc nhẹ, để 1 đến 2 phút quan sát và giải thích hiện tượng.
4) Phản ứng của vitamin D (canxipherol)
a) Phản ứng của vitamin D với anilin
Nguyên tắc: trong môi trường axit ,vitamin D tác dụng với anilin,tạo thành hợp chất màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1 ml clorofooc và 4 giọt thuốc thử anilin,lắc đều. trong ống nghiệm xuất hiện các thế nhũ tương có màu. Đun ống nghiệm sôi trong 30 giây, dung dịch biến đổi thành màu đặc trưng.
b) Phản ứng của vitamin D với SbCl3
Nguyên tắc: vitamin D tác dụng với SbCl3 trong clorofooc tạo thành hợp chất màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 1 ml dầu cá tan trong clorofooc. Lắc đều quan sát màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả
c)phản ứng với brome
Khi cho dung dịch Br2/CHCl3 vào dung dịch vitamin thì chất lỏng sẽ có màu xanh.
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 3 giọt dầu cá sau đó thêm giọt dung dịch Br2/CHCl3 .chờ môtl lúc dung dịch xuất hiện màu xanh.
II) Nhóm vitamin tan trong nước.
1) Phản ứng phát huỳnh quang của vitamin B1
a) phản ứng tạo thành thiocrom
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của ferrixianuakali, tiamin bị oxi hóa thành tiocrom. Dưới ánh sáng của tia tử ngoại, tiocrom phát huỳnh quang có màu đặc trưng.phản ứng như sau:
Nguyên liệu và hóa chất: Vitamin B1 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6] 1%, rượu izobutilic.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 20 giọt vitamin B1 1%, 10 giọt NaOH 10% và 5 giọt K3[Fe(CN)6] 1%. Lắc đều cho đến khi dung dịch xuất hiện màu. Thêm vào ống nghiệm 20 giọt rượu izobutilic, lắc đều, sau đó để yên, dung dịch trong ống tạo thành 2 lớp ngăn cách. Để ống nghiệm dưới ánh sáng mặt trời hay dưới ánh đèn tia tử ngoại, quan sát sự tạo thành huỳnh quang, giải thích kết quả.
b) phản ứng AgNO3
Nguyên tắc: Thiamin phản ứng với nitrat Ag để cho kết tủa màu xám.
Tiến hành
ùng 2ml dung dịch vitamin B1 ,axit hóa bằng axit nitric loãng 0.1% và them vào đó 1 ml dung dịch AgNO30.5%, các màng kết tủa xuất hiện.c) Phản ứng với thuốc thử diazo (hỗn hợp của axit sulfannilic và natri nitric)
Nguyên tắc: vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo sẽ cho màu vàng da cam hay đỏ
Nguyên tắc: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch axit sulfannilic vào 0.5 ml dung dich natri nitric, thêm vào đó vài giọt dung dịch vitamin B1 và 10 giọt carbonat Na 10%.Lắc ống nghiệm ta sẽ thấy màu đỏ da cam
2) Phản ứng của vitamin B6 (Pyridoxin) với FeCl3:
Nguyên tắc: Pyridoxin tác dụng với FeCl3 tạo thành phức chất có màu đặc trưng.phản ứng như sau:
Hóa chất: pyridoxin 1%; FeCl3 5%;
Dụng cụ: ống nghiệm (1); lọ đựng hóa chất (2)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml pyridoxin 1% và 5 giọt FeCl3¬, lắc đều.
Quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả?
3) Các phản ứng của vitamin C
a). Phản ứng của vitamin C với ferrixianuakali (K3[Fe(CN)6])
Nguyên tắc: Vitamin C có 2 nhóm enol linh động dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hoá khử với một số chất như: ferrixianuakali; 2,6 – diclorophenol indolphenol, iot.phản ứng xảy ra như sau:
Hóa chất: K3[Fe(CN)6] 5%; FeCl3 5%; axit ascorbic 1%.
Dụng cụ: ống nghiệm , lọ đựng hóa chất .
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml axit ascorbic 1%, 1ml K3[Fe(CN)6] 5% và 3 giọt FeCl3 5%, lắc nhẹ. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin C với 2,6-diclorophenol indophenol (2,6D)
2,6D trong môi trường kiềm có màu xanh, trong môi trường axit có màu hồng, khi tác dụng với vitamin C, phản ứng oxi hóa –khử diễn ra như sau:
Hóa chất:axit ascorrbic 1%, 2,6D 0.01%; HCl 2%
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 20 giọt 2,6D 0.01% và 2 giọt HCl 2%dung dịch xuất hiện màu.sau đó cho 10 giọt
B) ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
I)Xác định Vitamin A trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chuẩn bị dụng cụ:
- Hệ thống máy HPLC, Shimadzu
- Cột Purospher Star RP-18e( 150x4.6mm,5um)
- Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg
- bộ chưng cất có ống sinhhàn hồi lưu
- bình định mức 10ml
- pipet các loại : 0.1ml, 0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,...
- ống Hatch
- công cụ thủy tinh các loại: Becher, erlen.
Chuẩn bị hóa chất:
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích , gồm:
- nước cất loại dùng cho HPLC
- Dietyl ete tinh khiết không có Peroxit
- Etanol
- Dung dịch Kalihydroxyde( KOH) 2M trong cồn : hòa tan 11.2g KOH trong 100ml cồn 96o
- Dung dịch Kalihydroxyde ( KOH) 2% trong nước : Hòa tan 2g KOH trong 100ml nước cất
- Acetonnitrile, HPLC
- Na2SO4 khan.
Cách tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Nếu dùng chuẩn vitamin A thì phân tích ngay trên thiết bị HPLC. Nếu Dùng vitamin A dưới dạng este, thí dụ như vitamin A acetat, vitamin A palmitat,...thì phải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A ra thể tự do rồi mới tiến hành phân tích bằng HPLC.
Xây dựng đường chuẩn dùng Vitamin A palmitat
Quá trình xà phòng hóa:
Cân 18.32 mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A ( phân tử lượng của Vitamin A là 286, phân tử lượng của vitamin A Palmitat là 524) cho vào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M trong etanol và 0.5natri ascorbat. lắp ống sinh hàn hồi lưu . Đặt trên nồi cách thủy, xà phòng hóa ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút.
Chuyển dung dịch còn nóng vào một bình lóng, rửa bình cầu nhiều lần bằng H2O cất và tập trung nước rửa vào bình lóng.
Chú ý: lượng nước không được quá 3 lầnlượng KOH 2M để tránh hình thành nhủ tương có thể gây mất Vitamin A khi chiết.
Vitamin A từ dung dịch đã xà phòng hóa được chiết 3 lần bằng dietyl ete không có peroxit 3 lần, mỗi lần 40ml. Tập trung lớp ete chiết được vào một bình lóng. Rửa lớp ete nhiều lần với nước cất (mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm (thử với phenolphtalein). Loại nước trong dịch chiết etebằng cách lọc qua lớp Na2SO4 khan, rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lốp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan trong acetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml. Định mức đến vạch bằng acetonitrile. Dung dịch này dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc (1000mg/l)
Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút chính xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn gốc 1000ug/ml vào bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng ACN.
Chuẩn bị mẫu thử :
Cân khoảng 10g mẫu thử đã được nghiền nhỏ ( nếu cần) cho vào bình cầu thuỷ tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hoá như đã ghi ở phần trên.
Sau khi rửa dịch chiết ete bằng 15ml KOH 2% và nhiều lần với nước cất ( mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm ( thử với phenoltalein) . Loại nước trong dung dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp NaSO4 khan , rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn . Hoà tan phần còn lại bằng chính xác 1ml dung dịch pha động ( vortex 15giây và siêu âm 3 phút) . Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0.45um và thu dịch lọc và tiến hành phân tích trên HPLC.
Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi:
Cho thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10ng/ml vào 10g mẫu trắng . đồng nhất mẫu bằng chách siêu âm khoảng 1 phút. tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử.
Tiến hành phân tích trên HPLC:
Điều kiện phân tích :
- pha động
- tốc độ dòng
- detector UV, λ= 325nm
tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự sau:
- Các dịch chuẩn . Dựng đừơng chuẩn giữa nồng độ các chuẩn vitamin A và diện tích của các chuẩn Vitamin A. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính.
- Dung dịch mẫu trắng
- Dung dịch mẫu kiểm soát. tính hàm lượng các vitamin A trong dịch chiết. và trong mẫu thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên .Tính độ thu hồi mẫu kiểm soát (R).
- Các dung dịch mẫu thử nghiệm. tính hàm lượng vitamin A trong dịch chiết ( Co ) thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên.
Tinh kết quả:
Hàm lượng vitamin A có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C = Co/m
Trong đó:
- C là hàm lượng Vitamin A có trong mẫu Tính theo mg/Kg
- Co là hàm lượng Vatamin A trong dịch chiết.( Co) thông qua đường chuẩn, mg/L
- m : Khối lượng (g
II.Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ
1)Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP
a)Nguyên tắc:
Vitamin C (axit ascorbic) hòa tan trong nước, dễ bị phân hủy dưới tác dụng của các chất oxi hóa và bền trong môi trường axit. Vì vậy người ta thường chiết axit ascorbic của mẫu phân tích bằng các dung dịch axit như axit axetic 5%, axit metaphôtphoric 2%.
Phương pháp dựa trên nguyên tắc axit ascorbic có khả năng oxi hóa khử thuận nghịch chất chỉ thị 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP. Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu tốn tính ra lượng axit ascorbic có trong mẫu phân tích. Phản ứng xẩy ra như sau:
Chất chỉ thị này có khả năng chuyển màu khi PH của môi trường thay đổi từ kiềm sang axit, có màu tím trong khoảng PH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở PH < 4.
b)Hóa chất :
- Dung dịch HCl 1% và CH3COOH 5%.
- Dung dịch axit metaphosphoric (HPO3) 2% hay axit axetic 1%.
- Dung dịch amoni oxalate (C2H8N2O4) bão hòa.
- Tinh thể KI.
- Dung dịch H2SO4 2%.
- axit ascorbic (Vitamin C) tinh khiết ( bảo quản kín trong lọ màu tối).
- Dung dịch hồ tinh bột 1%.
- Dung dịch thuốc chỉ thị DPIP 0.001N: cân 0.15g DPIP cho vào bình định mức dung tích 500 ml, them 350ml nước cất, cho tiếp dung dịch đệm phôtphat PH = 6,9 đến 7,0 đến vạch mức. vì trong nước, thuốc thử bị phá hủy nhanh nên được pha với dung dịch đệm. Thuốc thử DPIP được bảo quản trong bình có màu ở nơi tối ( không quá 7 ngày).
- Dung dịch đệm phosphate PH = 6.9 đến 7,0: trộn 2 thể tích KH2PO4 (9,075 gam KH2PO4 trong 1 lit nước cất) và 3 thể tích Na2HPO4 (11,867 gam Na2HPO4 .2H2O trong 1 lit nước cất) với nhau trước khi đem dùng.
c)Tiến hành:
1. Cân 10 đến 50 g rau tươi hay 5 đến 10 g sản phẩm đóng hộp, tùy theo hàm lượng Vitamin C có trong từng lọ nguyên liệu. Cho mẫu vào cối sứ.
2. Cho thêm 4,5 ml HCl 1% (hay CH3COOH 5%) vào cối (ngập kín mẫu). Khi lấy mẫu tránh dung công cụ bằng sắt hay đồng. Nghiền mẫu không quá 10 phút.
3. Cho dịch nghiền vào bình định mức 100 ml. Cho thêm 25 ml axit metaphosphoric 2% ( hay chì axetat 5%) để loại bỏ protein. Lắc đều, tiếp tục cho thêm HCl 1% (hay axit oxalic 1%) để tráng cối và thêm đến vạch mức.
Khi thí nghiệm với các mẫu động vật thì dùng axit tricloaxetic (CCl3COOH) 20%, sao cho nồng độ của nó đạt 5% trong dung dịch (25 ml). Trong trường hợp không có axit metaphosphoric (HPO3) hay oxalic (C2H¬2O4) có thể dùng HCl 1% hay CH3COOH 5%. Lắc và để yên 10 phút, lọc.
4. Dùng pipet lấy 5 ml dịch chiết lọc cho vào bình nón 50 ml, thêm 5 ml dung dịch amoni oxalate bão hòa, 10 ml nước cất và chuẩn độ bằng dung dịch DPIP cho đến khi xuất hiện màu hồng bền ( không mất màu trong 10 phút). Trong truờng hợp dùng axit oxalic thì không cẩn cho thêm amoni oxalate nữa.
Song song làm thí nghiệm kiểm tra với các hóa chất sử dụng.
Chú ý: Khi xác định Vitamin C trong mẫu thí nghiệm phải phân tích ít nhất 2 mẫu, mỗi mẫu 3 bình thí nghiệm. Kết quả chuẩn độ 2 lần không sai khác quá 0,03 ml DPIP 0,001N.
Thời gian chuẩn độ không quá 2 phút và lượng thuốc thử DPIP dung để chuẩn độ khoảng từ 1 đến 2 ml (không quá 2 ml hay ít hơn 1 ml).
d)Tính kết quả:
Hàm lượng Vitamin C (mg %) tính theo công thức
Trong đó: a – Số ml dung dịch DPIP 0,001N dung chuẩn độ bình thí nghiệm,
b – Số ml dụng dịch DPIP 0,001N dung chuẩn độ ở bình kiểm tra,
f – hệ số dung dịch chuẩn,
V – Thể tích dịch chiết Vitamin C (ml),
w – khối lượng mẫu thí nghiêm (g).
Xác định hệ số f : hòa tan 1 đến 1,5 mg axit ascorbic vào 50 ml H2SO4 2%. Lấy 5 ml dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch DPIP 0,001N cho đến màu hồng bền. lấy vào bình định mức khác 5 ml dung dịch axit ascorbic trên, thêm một ít tinh thể KI (3 – 5 mg) và 5 giọt hồ tinh bột 1%. Chuẩn độ bằng dung dịch KIO3 0,001N cho đến khi xuất hiện màu xanh. Hệ số f được tính theo công thức:
Trong đó: 0,088 – số mg axit ascorbic ứng với 1ml dung dịc KIO3 0,001N (giống với 1ml dung dịch DPIP 0,001N).
a – số ml dung dịch KIO3 0,001N dùng để chuẩn độ 5 ml dung dịch axit ascorbic.
b – số ml dung dịch DPIP 0,001N để chuẩn độ 5 ml dung dịch axit ascorbic.
2) Phương pháp sử dụng iot:
a) Nguyên tắc:
Vitamin C có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi Vitamin C có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitaminC.
b) Hóa chất:
- Dung dịch HCl 5%.
- Dung dịch 0,01N.
- Dung dịch tinh bột 1%.
c) Tiến hành:
Cân 5 gam lá thì là tươi nghiền nhỏ trong cối sứ với 5 ml HCl 5%, nghiền kĩ, cho vào ống đong (hay bình định mức), dẫn đến vạch 50 ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20 ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100 ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh.
d)Tính kết quả:
Hàm lượng Vitamin C được tính theo công thức sau:
Trong đó: V – số ml dung dịch iot 0.01N dùn chuẩn độ
V1- thể tích dịch mẫu thí nghiệm (50ml)
V2- thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml)
w- khối lượng mẫu(g)
0.00088- số gam vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iot 0.01N
III. địng lượng vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang.
Sự phát quiang có thể được hiểu là năng lượng được tách ra khi các nguyên tử kích thích bởi các chùm sáng có bước song tới hạn, tương tự như hiện tượng lân quang. Tuy nhiên sự khác nhau,giữa hai hiện tượng này là phát huỳnh quang giải phóng ngay lập tức năng lượng ánh sáng hấp thụ từ một nguyên tử hay phân tử, còn lân quang giải phóng từ năng lượng hấp thụ. Cả hai đều là sự phát quang.
Rất nhiều hợp chất giàu e, như hợp chấy chứa hai hay nhiều nối đôi liên hợp và do có ∏-electron nên phát huỳnh quang.
Các e của một phân tử tồn tại trong điều kiện năng lượng thấp nhất (mức năng l ượng thấp nhất của trạng thái cơ bản)vì các e này không ổn định trong bất cứ một bậc năng lượng nào khác. Trạng thái cơ bản này là trạng thái năng lượng bình thường của một phân tử. nếu như phân tử này bị chiếu bởi bức xạ tử ngoại và nó hấp thụ một số proton thì phân tử này sẽ bị kích thíchđén một trạng thái năng lượng cao hơn. Hiện tượng này cũng giống như hiện tượng đã xảy ra khi một e hay các e thu năng lượng và nhảy từ trạng thái năng lượng cơ bản đến mức năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đầu tiên.
Theo lí thuyết lượng tử thì mức năng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một số trạng thái xác định ,cho nên chỉ có ánh sáng với những tần số tương ứng với năng lượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ. Bởi vì một trong rất nhiều trạng thái kích thích có thể được hình thành, nên các hợp chất có thể hấp thụ ánh sáng với các tần ssó khác nhau.
Quá trình hấp thụ xảy ra rất nhanh khoảng 10-15 giây. Electron se duy trì ở trạng thái kích thích từ 10-8 ddeens 10-4 giây. Sau đó nó sẽ bắt đàu nhảyvề trạng thái cơ bản. quá trình này có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng tỏa ra dưới dạng nhiêựt hay e rơi xuống mức dao động thấp nhất của trạng thái cơ bản ,đồng thời giải phóng một photon năng lượng và phát huỳnh quang. Do một lượng năng lượng dã bị mất trước khi e nhảy xuống trạng thái năng lượng thấp hơn ,nên năng lượng giải phóng dưới dạng photon phải có ít năng lượng hơn photon kích thích
Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát. Nhiều hợp chất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnh quang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,N hay S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên. Tuy nhiên một số nhóm có thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điều trên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khác nhau. Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phát quang tại cùng một bước sóng .sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợp chất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính. Nếu có sự nghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữ liệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này.
Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quá trình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước. không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụ cùng một bước sóng kích thích khác. Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hay thay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó.
Phép đo huỳnh quang cũng có thể được dùng trong phân tich dịnh lượng vì cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của hợp chất phát quang. Tuy nhiên mối liên quan trực tiếp này chỉ đúng với dung dịch rất loãng vì ánh sáng phát ra từ những chất phát quang đều phải di qua dung dịch trước khi đến máy đo quang vì thế một lượng ánh sáng sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử khác trong dung dịch. Nồng độ càng cao thì lượng ánh sáng phát xạ bị hấp thụ càng lớn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tăng tiến tới bão hòa và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lí do này mà đường chuẩn như vậy thường được dùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang ). Do đó một giá trị của cường độ huỳnh quang có thể sẽ tương ứng với hai giá trị nồng độ của chất phát quang.
Chất tan có ảnh hưởng đến tính chất phát huỳnh quang của một hợp chất. những chất tan khác nhau có thể làm tăng hay giảm cường độ phát quang. Cũng như vậy hằng số điện môi thể hiện mức độ phát quang tự do của các điện tử л và do đó thể hiện sự thay đổi bước sóng cực đại huỳnh quang. Dung dịch đệm có xu hướng gây ảnh hưởng dập tắt bước sóng của một số chất và ảnh hưởng này tăng khi dung dịch đệm tăng lên.
Cường độ phát huỳnh quang của một hợp chất dễ bị ion hóa sẽ thay đổi theo trạng thái ion hóa mà quá trình ion hóa này lại phụ thuộc độ PH. Nhiều hợp chất sinh học có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên hay pháy huỳnh quang hóa học dễ bị ion hóa, cường độ phát huỳnh quang của những chất này phụ thuộc vào PH. Một số hợp chất bị ion hóa bởi ánh sáng và do đó phát huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ càng cao thì tốc độ chuyển động của các phân tử trong dung dịch càng tăng. Do đó năng lượng hấp thụ chuyển thành nhiệt chứ không phải là huỳnh quang.
Với một số chất không bền trong dung dịch ,tốc độ phân hủy quang phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Phần lớn các chất phát huỳnh quang phân hủy thành các chất không phát huỳnh quang. Tuy nhiên một số phân hủy thành chất có độ huỳnh quang thậm chí còn cao hơn chất ban đầu.
Phần lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mở được ở ghiữa nguồn sáng và mẫu thí nghiệm, khe này được mở ngay trước khi đo để giảm tối thiểu sự phân hủy quang.
Sự dập tắt xảy ra khi sự phat huỳnh quang của một chất bị giảm bởi một chất khác. Có hai loại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật. ảnh hưởng màng lọc xảy ra khi màng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hay ánh sáng phát xạ. còn sự dập tắt thật thì xảy ra khi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biến thành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dập tắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang. Có thể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trong dung dịch. Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi.
Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và độ nhạy. tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so với phương pháp quang phổ hấp thụ.
Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bước sóng của ánh sang kích thích. Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứn ánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,cho nên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp. trong các kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác, do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau.
Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:
- Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ
- Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ không phải là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ.
Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàm lượng vitamin B2.
1.Nguyên tắc:
Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B2) là chất có màu vàng-xanh lá cây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang .riboflavin có nhiều trong tế bào động vật và thực vật. nó bền trong muối khoáng và phần lớn các tác nhân oxi hóa ,nhưng lại không bền trong dung dịch kiềm.nó rất nhạy cảm với tia khả kiến và tia tử ngoại nên các thap tác được thực hiện trong ánh sáng dịu hay trong các công cụ thí nghiệm thủy tinh có độ quang hóa thấp
Trong các tế bào sống ,riboflavin thừờng kết hợp với axit photphorichoawcj cả với axit adenylic (FMN hay FAD). Cả 2 đều có thể kết hợp một số protein đặc thù để hình thành các enzyme oxi hóa. Trong một số sản phẩm ( sữa), riboflavin tồn tại dưới dạng tự do có thể thẩm tách cũng như dạng coenzyme.
Trong phần lớn các quy trình riboflavin, cần thiết phải xử lý các sản phẩm tự nhiên với axit hay enzyme để thu được giá trị tối đa. Bước xử lý này giải phóng riboflavin khỏi phức chất protein và giúp cho việc tách chiết dễ dàng hơn.
Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ quét tự vi. Dùng máy quang phổ huỳnh quang quét có điều khiển để điều chỉnh sự phát huỳnh quang của riboflavin khi có mặt những chất gây cản trở, những chất này theo lý thuyết có ảnh hưởng đến các chất chuẩn và mẫu thí nghiệm. Do đó cường độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ của riboflavin trong dung dịch loãng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênh lệch độ huỳnh quang trước và sau sự khử Natritiosunfit (Na2S2O4 ).
2) Tiến hành
a) Quy trình thí nghiệm tách chiết
1.cân 6.0 g ngũ cốc (dự tính là chứa 5 đến 10 microgam riboflavin), nghiền bằng cối sứ.
2.đổ vào bình nón 100 ml và them 50 ml dung dịch HCl 0.01M. lức bình để tẩm ươt hết ngũ cốc. sau đó đậy nắp bình bằng giấy nhôm (tốt nhất là giấy bạc) để tránh riboflavin bị phân hủy bởi ánh sáng. Đặt trong nồi cách thủy đang đun sôi khoảng 1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần. kiểm tra mức nước mỗi lần lắc bình, không để nước cạn.
3.Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnh đến 6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)
Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin.
4.Ngay lập tức them HCl 1M để giảm PH đến 4.5.li tâm bằng ống li tâm thủy tinh 100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút.
5.Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức.
b) Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết
1.Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằng máy trộn.
2.Lấy 2ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩn riboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều.
3.Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút.
4.Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO4 3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút.
5.Cho 0.5 ml H2O2 3% vào mỗi ống và trộn đều. màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10 giây.
c) Đo độ huỳnh quang của dịch chiết
1.Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thích phải được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer).
2.Xác định cực đại của bước sóng phát xạ và bước sóng kích thích của dung dịch chuẩn riboflavin (nồng độ 1 microgam/ml riboflavin) giá trị cực đại cho kích thích nên có giá trị là 450 nm. Giá trị cực đại cho phát xạ là 530nm.
F =2.303.Ф.p0.έ.b.c
Trong đó: Ф –hiệu suất lượng tử
P0 –cường độ tối
έ – độ hấp thụ phân tử
b –độ dài đường dẫn
c – nồng độ
Phương trình này chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ thấp. ở phương trình trên,cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với cường độ tối p0 và nồng độ c. độ huỳnh quang sẽ tăng khi p0 tăng (hay công suất của nguồn tăng), độ huỳnh quang cũng tăng khi nồng độ của chất phát quang tăng.
Để thành lập mối lien quan theo định luật Lambert-Beer, có một đường chuẩn độ cho riboflavin chứa 0.5 – 1.0 – 2.0 và 4.0 microgam/ml.
Chú ý: Trong khi đo huỳnh quang, phải để cẩn thận tránh không cho dung dịch tiếp xúc với tia tử ngoại quá lâu nếu không sẽ làm riboflavin bị phân hủy rất nhanh.
3.Đo độ huỳnh quang của dịch chiết không chứa riboflavin (kết quả A). dung 3ml dung dịch trong cuvett.
4.Cho vào cuvett đã chứa 3 ml dịch chiết này khoảng 5mg Na2S2O4 (pha trong nước) trộn đều và đo ngay lập tức (kết quả C)
5.Đo độ huỳnh quang của dịch chiết có chứa riboflavin thêm vào (kết quả B).
3) Tính kết quả
Tính lượng riboflavin có trong ngũ cốc bằng công thức sau:
4) Báo cáo thí nghiệm
1. vẽ một đường chuẩn để thành lập mối liên hệ theo định luật Lambert-Beer cho riboflavin, dung dung dịch riboflavin chuẩn 0.5;1.0;2.0 và 4 micrôgam/ml.
2.So sánh kết quả thu được với giá trị như trên vỏ hộp (đã được xác định bởi nhà sản xuất).
3.Vẽ cấu tạo hóa học của riboflavin và chỉ ra bản chất của những phần phát huỳnh quang.
4.Sự tăng lượng tử của một chất ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang như thế nào?
IV. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang
1)Nguyên tắc
Khi oxi hóa vitamin B1(thiamin) bằng kali feroxianua trong môi trường kiềm sẽ tạo thành hợp chất thiochom,chất này có màu huỳnh quang xanh dưới ánh sáng tử ngoại.Cứ một phân tử thiamin sẽ tạo thành một phân tử thiocrom.
Để xác định hàm lượng thiamin, người ta dùng dung dịch chuẩn thiamin tinh khiết so sánh với dung dịch nghên cứu. trước khi tiến hành các phản ứng, thiamin phải được giải phóng ra khỏi mẫu bằng chế phẩm enzim photphataza , papayolin ,hay takađiataza.
2)Hóa chất
-Dung dịch H2SO4 0.1N.
-Dung dịch CH3COOH 30%.
-Dung dịch NaOH 15%.
-Dung dịch kaliferoxianua [K3Fe(CN)6] 1%chẩn bị để dùng trong ngày và giữ trong lo mầu.
-Rượu butylic (C4H9OH) hay isoamylic [(CH3)2CH(CH2)2OH]: các rượu này không được phát huỳnh quang. Nếu phát huỳnh quang phải khử bằng than hoạt tính(15 g than cho vào 1 ml rượu): rượu trộ với than lắc 30 phút trên máy lắc ,lọc làm khan bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp.
-Chế phẩm photphataza của khuẩn ti penicillium: khẩn này được sấy khô ở nhiệt độ 400c. lấy 10 mg khuẩn này nghiền với 1ml dung dịch natri axetat 30%, chuyển vào bình định mức, thêm natri axetat đến PH=5.
-Dung dịch vitamin B1 chuẩn
+Dung dịch gốc(a): 10mg thiamim tinh thể hòa tan vào 10ml HCl 0.01N.Chuyển dung dịch vào bình định mức dung tích 100ml.Thêm cất đến vạch,lắc kỹ.Đựng trong chai màu nâu,để ở chổ mát có thể dữ được một tháng.Cứ 1ml dung dịch này chứ 100γ –thiamim.Lấy 1ml dung dịch này cho vào bình dịnh mức dung tích 100ml,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,1ml dung dịch này chứa 1 γ thiamim.
+ Dãy dung dịch thiamim chuẩn(b):từ dung dịch trên cho vào các ống nghiệm lần lượt 0.5;1.0;1.5;2ml(chứa 0.5;1.0;1.5;2 γ thiamim ),thêm vào các ông nghiệp lần lượt 4.5;4.0;3.5;3.0ml nước cất và 1ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% (mới pha).Cuối cùng cho vào mỗi ống 3ml dung dịch NaOH 1%.Lắc nhanh,mỗi ống lại cho thêm 10ml rượu butylic,lắc.Để yên 10 phút ,dung dịch sẽ tách thành 2 lớp.Li tâm ,tách bơ lớp dưới,cho vào 1g Na¬2¬SO4 khan.Dung dịch rượu khan chứa thiỏcom được cho vào dãy ống nghiệp khác.Ta được dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2-3 ngày.
3)Tiến hành:
1.Cân 5-10g mẫu, nghiền trong cối sứ với 10-15ml H2SO4 0.1N.Chuyển vào bình định mức cỡ 100ml,thêm H2SO4 đến 75ml.
2.Đặt bình vào nồi cách thủy sôi trong 45 phút ,lắc điều, để nguội vào thêm chế phẩm photphataza vào( cứ 1g mãu cần 0.03g khuẩn ti khô)bằng cách:cân khuẩn ti,đem nghiền trong cối với 2-3ml natri axetat 30% rồi chuyển vào bình định mức, thêm natri axetat đến pH=5.
3.Đặt bình vào máy ổn nhiệt ở 40oC trong 12 giờ.Sau đó lấy bình ra,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,lọc.
4.Hút lấy 5ml nước lọc cho vào phiễu chiết,thêm 10ml rượu butylic,lắc mạnh 1-2 phút ,chiết tách bỏ lớp rượu .Thêm vào 1ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 3ml NaOH 15% ,lắc nhanh và thêm 10ml rượu butylic.Lắc,tách bỏ lớp nước.Lọc lớp rượu qua giấy lọc chứa NaOH khan.Chuyển dung dịch vào ống nghiệm.
5.Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thí nghiệm so với dãy dung dịch thiamim chuẩn trên máy quang phổ dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh,thủy ngân TIK-4,kính lọc màu đen(kích thước là 432ml nm,sự phát xạ là 545nm).
4)Tính kết quả:
Hàm lượng vitamim B1(mg%)được tính theo công thứ sau:
Trong đó:
a- lượng vitamim có trong ống nghiệm chuẩn có màu huỳnh quang trùng với mẫu ống nghiệm (γ).
V-dung tích bình định mức(ml).
V1- thể tích dung dịch thí nghiệm lấy để oxi hóa(ml).
w- khối lượng mẫu(g).
1000-chuyển từ γ ra mg.
V.Chuẩn hoá phương pháp xác định hàm lượng Vitamin D ( D2 và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC
Nguyên tắc: Xác định vitamin D (D2 and D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Để chuẩn hoá phương pháp này phù hợp với phòng thí nghiệm chúng tui đã tiến hành khảo sát và phân tích bằng HPLC của hãng Finnigan. Mẫu được xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxit trong môi trường ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở nhiệt độ 75oC trong 1 giờ. Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin D) được chiết bằng ete dầu hoả và làm sạch qua cột SPE. Bơm dung dịch rửa giải thu được vào hệ thống sắc ký và xác định vitamin D định bằng detector DAD ở bước sóng 265nm. Kết quả thu được cho giới hạn phát hiện của vitamin D2 và D3 là 2,2 và 3,4ppb; giới hạn định lượng tương ứng là 7 và 11ppb; độ thu hồi của vitamin D đạt 75-90 %.
Link download bản doc:
You must be registered for see links
Tags: xác định hàm lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn độ, nêu định tính định lượng và bảo quản của vitamin a, định lượng vitamin B3 bằng HPLC, phương pháp xác định hàm lượng vitamin c, Định tính và định lượng Ascorbic acid Phương pháp chuẩn độ, HPLC, xác định hàm lượng vitamin C bằng iot, Định tính vitamin E bằng HNO3, định lượng axit ascorbic hiện tượng giải thích, Có thể định lượng vitamin B1 sau khi cho phản ứng tạo thiocrom bằng cách nào?