Download miễn phí Bài giảng Công nghệ ADN tái tổ hợp
Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh
vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở
người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứuđã phát
triển được véctơ nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men có thể mang
các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo
ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Đại học khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia hà nộiKhoa sinh học - bộ môn di truyền học
CễNG NGHỆ
ADN TÁI TỔ HỢP
Di truyền học phân tử và tế bàoĐINH ĐOàN LONG
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đ−ợc thực hiện nh− thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đ−ợc thực hiện nh− thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
3
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp (recombinant
DNA) đ−ợc dùng để chỉ các
phân tử ADN đ−ợc tạo ra từ
hai hay nhiều phân đoạn ADN
xuất xứ từ các nguồn gốc khác
nhau.
Trong thực tế, công nghệ ADN
4
tái tổ hợp đôi khi đ−ợc dùng
đồng nghĩa với các thuật ngữ
nhân dòng phân tử
(molecular/DNA cloning), hay
kỹ thuật di truyền (genetic
engineering). Nh−ng thực chất
các thuật ngữ này có khác
nhau.
Khái niệm chung
Mục đích
1. Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế
bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng
gen riêng lẻ.
2. Nhân một dòng gen đã đ−ợc phân lập lên một
số l−ợng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu
5
nghiên cứu.
3. Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới.
Vật liệu tách dòng gen
1. ADN
2. mARN (sử dụng kỹ thuật RT-PCR).
6
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đ−ợc thực hiện nh− thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
7
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
ADN tái tổ hợp thực hiện nh− thế nào?
Các b−ớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp
1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm.
2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3’, 5’ phù hợp.
3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp.
4. Cải biến đầu 3’ và 5’của véctơ và phân tử ADN ngoại lai.
8
5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai.
6. Đ−a véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên.
7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp.
8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các
mục đích nghiên cứu khác nhau.
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đ−ợc thực hiện nh− thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
9
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN
Các dung môi hữu cơ làm mất n−ớc, thay đổi môi tr−ờng điện môi
→ kết tủa protein & ADN.
Độ pH th−ờng trung tính hay hơi kiềm (7,0 – 8,5).
Phenol, chloroform, isoamylalcohol th−ờng đ−ợc dùng để kết tủa
protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1).
Một số hợp chất chống oxy hóa nh− 2-mercapthoethanol, DTT
10
(dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính
axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào. EDTA loại các ion kim loại.
Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) đ−ợc dùng để
kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và
làm giảm khả năng tan của axit nucleic. To -20oC / 0oC (1/2h – 24h).
CTAB loại bỏ các hợp chất polysaccharide / polyphenol ở thực vật.
Lysozyme đ−ợc dùng để phân giải lớp peptidoglycan ở vi khuẩn.
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
BỔ SUNG
PHENOL
ADN và ARN
trong n−ớc
LẮC
MẠNH LY TÂM
11
DÙNG PHENOL LOẠI PROTEIN KHỎI DỊCH CHIẾT ADN VÀ ARN
ADN, ARN và
protein trong
pha n−ớc
Phenol
Protein
trong phenol
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN
Để tách chiết mARN, ng−ời ta th−ờng dùng cột Oligo dT
– celluloza, hay cột hấp thụ từ tính với biotin-oligo(dT).
Định tính và định l−ợng ADN dựa trên ph−ơng pháp điện
di và đo quang phổ ở các b−ớc sóng 260 và 280 nm.
1,0 A260nm ≈ 50 àg / ml dsADN
12
1,0 A260nm ≈ 40 àg / ml ssADN / ARN
1,0 A260nm ≈ 33 àg / ml dNTP / oligonucleotide
ĐIệN DI PHÂN TíCH AXIT NUCLEIC
Gel polyacrylamid ADN 1 – 1000 bp
Gel agarose ADN / ARN 20 bp – 20 kb
PFGE ADN 10 kb – 10 Mb
DGGE ADN/ARN Sai khác một vài nucleotit
Gradient biến tính 0% 70%
4
0
%
Cá c giếng tra mẫu Điện cực
13
G
r
a
d
i
e
n
t
b
i
ế
n
t
í
n
h
4
0
%
7
0
%
C
h
i
ề
u
d
ị
c
h
c
h
u
y
ể
n
c
ủ
a
A
D
N
Thể đột biến 1
dễ biến tính hơn
Thể đột biến 2
khó biến tính hơn
ADN
kiểu dại
DGGE vuông góc DGGE song song
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đ−ợc thực hiện nh− thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Nội dung
14
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
Nhân dòng gen và xây dựng ngân hàng gen
Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen
Về vectơ / thể truyền
Vectơ nhân dòng
Vectơ biểu hiện
1. Kích th−ớc càng nhỏ, kích th−ớc đoạn xen càng lớn.
2. Trình tự nucleotit đ−ợc biết đầy đủ.
15
3. Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.
Các đặc tính chung của véctơ
1. Kích th−ớc càng nhỏ, kích
th−ớc đoạn xen càng lớn.
2. Trình tự nucleotit đ−ợc biết
đầy đủ.
3. Có trình tự khởi đầu sao chép
phù hợp tế bào chủ.
4. Nhận biết nhờ các gen chỉ thị
Vectơ nhân dòng và Vectơ biểu hiện
16
hay gen đánh dấu.
5. Có vị trí gắn phân tử ADN
ngoại lai (vị trí đa tách dòng
– polycloning site / MCS).
Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách dòng
17
véctơ plasmid
Kích th−ớc 1 –
200 kb, sợi kép,
vòng.
pBR332 do
Bolivar và
Rodiguez
18
pBR332
4363 bp
(1977) thiết
kế cho phép
mang đoạn
ADN cài đến
6 kb.
plasmid
Nhóm pUC là
nhóm véctơ
plasmid thuộc
thế hệ thứ 3.
Chứa cả điểm
khởi đầu sao
19
Th−ờng mang
dấu chuẩn là
Ampr và LacZ.
chép của phage
M13 cho phép
tách dòng nhờ
véctơ helper.
Plasmid pUC
20
Plasmid pUC
Các plasmid pUC
sao chép theo kiểu
θ khi không có
véctơ trợ giúp
(helper).
Khi có các véctơ
21
helper (vd. M13), các
plasmid pUC sao chép
theo kiểu vòng lăn, tạo
mạch đơn và giải
phóng ra ngoài nhờ
protein vỏ virut.
Plasmid pM13
Bản chất là
phân tử ADN
mạch đơn.
Không làm
phân giải tế
bào chủ khi
22
giải phóng
khỏi tế bào
nên tách dòng
thuận tiện
véctơ plasmid
Cấu trúc đơn giản, kích th−ớc nhỏ.
−u điểm
Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.
Có thể nhân lên với số l−ợng lớn, tốc độ nhanh.
23
Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.
Nh−ợc điểm
Không tách dòng đ−ợc các phân đoạn ADN kích
th−ớc lớn (> 10 kb).
Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.
véctơ Phage
Phần lớn xuất phát từ
phage λ.
Kích th−ớc khoảng 48,5 kb.
Có thể mang các đoạn
ADN cài đến ~20 kb.
(virut có thể đóng gói
24
ADN đến 40-50 kb)
Khả năng xâm nhập tế
bào chủ nhanh. Có thể
tách dòng ở cả prokaryote
và eukaryote.
véctơ phage
Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách
dòng ở cả prokaryote và eukaryote
−u điểm
Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.
Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC).
25
Kích th−ớc lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp
hơn.
N...