mandoline2609
New Member
Download miễn phí Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền cây đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD
MỤC LỤC
CHưƠNG TRANG
Trang tựa . i
Lời Thank . iii
Tóm tắt . iv
Abstract . vi
Mục lục . viii
Danh sách các chữ viết tắt . xii
Danh sách các bảng . xiii
Danh sách các hình . xiv
Chương 1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích . 2
1.3. Yêu cầu . 2
1.4. Giới hạn của đề tài . 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,
Tp. Hồ Chí Minh . 3
2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển . 3
2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 4
2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên . 4
2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh . 6
2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ . 7
2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay . 8
2.2. Cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) . 9
2.2.1. Phân loại . 9
2.2.2. Hình thái học . 10
2.2.3. Phân bố . 11
2.2.4. Giá trị kinh tế . 11
2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid) . 12
2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật . 13
2.3.2. Các phương pháp định lượng, định tính DNA . 14
2.3.2.1. Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ . 14
2.3.2.2. Định tính DNA bằng phương pháp điện di . 15
2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) . 16
2.4.1. Các loại enzyme giới hạn . 16
2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn . 16
2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA . 16
2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) . 18
2.5.1. Khái niệm . 18
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR . 18
2.5.3. Quy trình phản ứng PCR . 19
2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng . 20
2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) . 21
2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền . 21
2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử . 22
2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) . 22
2.9.1.1. Khái niệm . 22
2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP . 23
2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) . 24
2.9.2.1. Khái niệm . 24
2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP . 26
2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) . 27
2.9.3.1. Khái niệm . 27
2.9.3.2. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD . 29
2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD . 29
2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD . 29
2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền
và phát hiện chỉ thị phân tử . 30
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM . 31
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện . 31
3.1.1. Thời gian thực hiện . 31
3.1.2. Địa điểm thực hiện . 31
3.2. Vật liệu thí nghiệm . 31
3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu . 31
3.2.2. Cách ký hiệu mẫu . 31
3.2.3. Cách lấy mẫu . 32
3.2.4. Cách bảo quản mẫu . 32
3.3. Phương pháp thí nghiệm . 32
3.3.1. Quy trình ly trích DNA . 32
3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA . 32
3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA . 33
3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phương pháp quang phổ . 35
3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phương pháp
điện di trên gel agarose . 35
3.3.2. Kỹ thuật RAPD . 35
3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD . 35
3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm . 37
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 42
4.1. Kết quả thu thập mẫu Đưng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ . 42
4.2. Bảo quản mẫu . 43
4.3. Kết quả OD (Optical Density) . 44
4.4. Kết quả điện di . 45
4.4.1. Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 1 . 45
4.4.2. Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 2 . 45
4.4.3. Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 3 . 47
4.5. Kết quả phản ứng RAPD . 49
4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10 . 49
4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đưng cùng một số cây ngập mặn khác . 50
4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 . 53
4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD
với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn . 53
4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD . 56
4.6. Bước đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đưng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS . 56
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 61
5.1. Kết luận . 61
5.2. Đề nghị . 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 63
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
nh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản,hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10]
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự
đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu
bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn
DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra
các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm
nghiệm thực phẩm. [5]
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hay là gene quy
định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch
của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc
kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính
này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số
lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm
ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA
xác định, cần có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.
19
2.5.3. Quy trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc
Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các
thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt
độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử
DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.
Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong
thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của
các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase,
các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn.
Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và
thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều
lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40
chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm
đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hay
gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm).
20
Andy Vierstraete, 1999.
Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20]
2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF)
(1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là
hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài
và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh
học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di
truyền. [13]
Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là
nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các
loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho
21
nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái
quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính
bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội
đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa
dạng sinh học sẽ giúp loài ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất
những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà
kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ.
Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa
con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ
sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ
hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách
nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững.
2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity)
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ
gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một
loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột
biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene
đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể
khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền.
2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên
đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng
với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di
truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật
nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời.
22
2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị
phân tử
Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick
phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát
minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học
với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa
dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau
[7]:
Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…
Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP.
2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism)
2.9.1.1. Khái niệm
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa
các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và
kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử ...