Các kỹ thuật phân tích protein 1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạch protein Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận “mù mờ”. Chẳng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về hoạt tính của một enzym ADN polymerase trong một hỗn hợp protein thô (chẳng hạn từ dịch phân giải tế bào), các enzym ADN polymerase và protein thành phần khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát được trong thực nghiệm. Vì vậy, việc tinh sạch các protein là một bước quan trong trong quá trình tìm hiểu về chức
Các kỹ thuật phân tích
protein
1. Chuân bị dịch chiêt tê bào đê tinh sạch
• • •
protein
Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường họp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu
r r
này thường dân đên những kêt luận “mù
A 55
mờ .
Chăng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về hoạt tính của một enzym ADN polymerase trong một hỗn hợp protein thô (chẳng hạn từ dịch phân giải tế bào), các enzym ADN polymerase và protein thành phần khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát được trong thực nghiệm. Vì vậy, việc tinh sạch các protein là một bước quan trong trong quá trình tìm hiểu về chức năng của chúng.
Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm việc tinh sạch chúng thường có tính đặc thù. Điều này thì trái ngược với ADN, vốn cơ bản giống nhau về cấu trúc và thành phần, chỉ khác nhau về trình tự của các nucleotit. Các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù của nó về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là chức năng của chúng.
Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quá trình tinh sạch protein từ sinh vật là các dịch chiết tế bào. Không giống ADN vốn có tính phục hồi cao trong các điều kiện nhiệt độ sống khác nhau, thì protein rất dễ bị biến tính và phá hủy sau khi bị giải phóng ra khỏi tế bào. Vì lý do này, hầu hết quá trình chuẩn bị các dịch chiết và tinh sạch protein được tiến hành ở nhiệt độ lạnh (4oC). Có một số cách chuẩn bị dịch chiết tế bào. Các tế bào có thể phân giải bằng sử dụng chất tẩy, các lực làm vỡ thành tế bào, xử lý với dung dịch nhược trương (làm tế bào trương lên do nước đi vào và vỡ ra), hay thay đôi đột ngột áp suất. Điểm chung của tất cả các phương pháp là làm thành tế bào vỡ ra và các protein được giải phóng. Trong một số trường hợp, các tế bào được chuyển về trạng thái đông lạnh trước khi được nghiền bằng những máy nghiền mẫu trong phòng thí nghiệm.
2. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein
Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột. Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hay polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp. Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein. Các quy tành khác nhau được thiêt lập có thê khác nhau do đặc tính khác nhau của các loại protein. Ở đây mô tả ba phương pháp. Trong hai phương pháp đầu, protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích điện của chúng. Tóm tắt về các phương pháp này được nêu trên hình 14.
Sắc ký trao đổi ion: Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân lập dựa trên điện tích ion hóa bề mặt của
• • • chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hay dương (đây còn được gọi là pha tĩnh). Các phân tử protein tương tác yếu với các hạt (chẳng hạn như một phân tô protein tích điện dương được cho chạy qua cột mang các hạt tích điện âm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muỗi loãng chảy qua cột sau đó (dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân tử tương tác với pha động càng mạnh, càng cần dung dịch hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làm "trung hòa" các vùng mang điện tích và vì vậy cho phép các phân tử protein được giải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân tử protein khác nhau, kể cả các phân tử có đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột.
Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cở sở đặc
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Các kỹ thuật phân tích
protein
1. Chuân bị dịch chiêt tê bào đê tinh sạch
• • •
protein
Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường họp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu
r r
này thường dân đên những kêt luận “mù
A 55
mờ .
Chăng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về hoạt tính của một enzym ADN polymerase trong một hỗn hợp protein thô (chẳng hạn từ dịch phân giải tế bào), các enzym ADN polymerase và protein thành phần khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN quan sát được trong thực nghiệm. Vì vậy, việc tinh sạch các protein là một bước quan trong trong quá trình tìm hiểu về chức năng của chúng.
Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm việc tinh sạch chúng thường có tính đặc thù. Điều này thì trái ngược với ADN, vốn cơ bản giống nhau về cấu trúc và thành phần, chỉ khác nhau về trình tự của các nucleotit. Các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù của nó về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là chức năng của chúng.
Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quá trình tinh sạch protein từ sinh vật là các dịch chiết tế bào. Không giống ADN vốn có tính phục hồi cao trong các điều kiện nhiệt độ sống khác nhau, thì protein rất dễ bị biến tính và phá hủy sau khi bị giải phóng ra khỏi tế bào. Vì lý do này, hầu hết quá trình chuẩn bị các dịch chiết và tinh sạch protein được tiến hành ở nhiệt độ lạnh (4oC). Có một số cách chuẩn bị dịch chiết tế bào. Các tế bào có thể phân giải bằng sử dụng chất tẩy, các lực làm vỡ thành tế bào, xử lý với dung dịch nhược trương (làm tế bào trương lên do nước đi vào và vỡ ra), hay thay đôi đột ngột áp suất. Điểm chung của tất cả các phương pháp là làm thành tế bào vỡ ra và các protein được giải phóng. Trong một số trường hợp, các tế bào được chuyển về trạng thái đông lạnh trước khi được nghiền bằng những máy nghiền mẫu trong phòng thí nghiệm.
2. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein
Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột. Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hay polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp. Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein. Các quy tành khác nhau được thiêt lập có thê khác nhau do đặc tính khác nhau của các loại protein. Ở đây mô tả ba phương pháp. Trong hai phương pháp đầu, protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích điện của chúng. Tóm tắt về các phương pháp này được nêu trên hình 14.
Sắc ký trao đổi ion: Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân lập dựa trên điện tích ion hóa bề mặt của
• • • chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hay dương (đây còn được gọi là pha tĩnh). Các phân tử protein tương tác yếu với các hạt (chẳng hạn như một phân tô protein tích điện dương được cho chạy qua cột mang các hạt tích điện âm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muỗi loãng chảy qua cột sau đó (dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân tử tương tác với pha động càng mạnh, càng cần dung dịch hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làm "trung hòa" các vùng mang điện tích và vì vậy cho phép các phân tử protein được giải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân tử protein khác nhau, kể cả các phân tử có đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột.
Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cở sở đặc
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: