hoangtv1989
New Member
Download miễn phí Luận văn Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời Thank
Danh mục những chữ viết tắt trong luận văn
Danh mục các bảng trong luận văn
Danh mục các hình trong luận văn
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa khoa học 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh 3
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh 3
1.1.3. Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh 7
1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh 8
1.1.5. Tầm quan trọng của cây đậu xanh 9
1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh 10
1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 15
1.2.1. Hạn và tác động của hạn đối với cây trồng 15
1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 17
1.2.3. Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. VẬT LIỆU 24
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.3.1. Phương pháp sinh lí, hoá sinh 26
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử 30
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 36
3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh 36
3.1.2. Chiều dài rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non 38
3.1.3. Đặc điểm hoá sinh hạt của các giống đậu xanh 39
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON 42
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP 46
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 46
3.3.2. Kết quả nhân gen LTP 47
3.3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 48
3.3.4. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 48
3.3.5. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng clony-PCR 49
3.3.6. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu 50
3.3.7. Kết quả xác định trình tự nucleotide của 2 mẫu nghiên cứu 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [27]. Ở đậu xanh, gen LTP cũng đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen quốc tế [34].1.2.3. Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein)
1.2.3.1. Protein LTP
LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật.
LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước. LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP - linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [39].
Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn. Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003) nhận thấy rằng hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao [41].
LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật. Nghiên cứu trên cây lúa, Blilou I. và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh khi có sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi nấm tấn công vào khoảng gian bào [24]. Carvalho A.O. và cs (2006) khi nghiên cứu trên cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy LTP là peptide kháng khuẩn tham gia vào việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [26].
LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử. Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [36].
1.2.3.2. Gen LTP
LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Vai trò của LTP là tham gia vào cấu tạo cutin, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và đáp ứng sự thích nghi biến đổi của môi trường [25], [29], [35].
Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh… Những phân tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cystein làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [36].
LTP đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh như: Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani, Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola [36], [45].
Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực vật như: Arabidopsis thaniana L. [22], Paphanus sativus L. [53], Zea mays L. [49], [51], Capsicum annuum [55], Vigna radiata L. [41], Triticum L. [44], Daucus carota L. [52], Nicotiana tabacum L. [43], [48], Oryza sativa L. [56], Valencia orange [60], Lycopesium esculentum [54].
LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng của tế bào. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hay lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường [23], [25].
Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:
Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả.
Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được biểu hiện trong hạt.
Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được biểu hiện trong mô lá. Chúng được tạo ra khi có những ảnh hưởng của môi trường như tình trạng khô hạn và các tác nhân có thể gây bệnh.
Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptide được cô lập và biểu hiện trong hoa [36], [45].
Ở cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41]. Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật. Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ. Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối hay khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Hạt của 13 giống đậu xanh do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và một số giống thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Hà Giang. Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các giống đậu xanh nghiên cứu
TT
Tên giống
Nguồn gốc
1
ĐXVN 4
Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống Mungo 113 với ĐX 113
2
ĐXVN 5
Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 04 với ĐX 113
3
VN 99-3
Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống VN 93-1 với Vigna mungo
4
044/ĐX06
Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06
5
TN
Đồng Hỷ - Thái Nguyên
6
LS
Bắc Sơn - Lạng Sơn
7
HN 1
Ba Vì - Hà Nội
8
HN 2
Mỹ Đức - Hà Nội
9
BG 1
Việt Yên - Bắc Giang
10
BG 2
Yên Dũng - Bắc Giang
11
BG 3
Sơn Động - Bắc Giang
12
HG 1
Bắc Quang - Hà Giang
13
HG 2
Hoàng Su Thùy - Hà Giang
VN 99-3
LS
044/ĐX06
BG 1
HG 2
BG 2 22
BG 3
ĐXVN 5
HN 2
HG 1
ĐXVN 4
TN
HN 1
Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các loại hóa chất: các hoá chất phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp.
Các loại thiết bị máy móc: các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân tử như máy PCR, máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, máy xác định trình tự nucleotide tự động, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy móc cần thiết khác.
Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Phòng thí nghiệm Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Phòng Miễn Dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí, hoá sinh
2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn
Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998) [1].
Hạt đậu xanh được gieo vào trong các chậu trồng cây chứa cát vàng sạch. Sau khi cây có 3 lá thật, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn cho cây che không cho nước mưa có thể vào chậu thí nghiệm, thời điểm tiến hành thí nghiệm