hoangtram_dethuong
New Member
Download miễn phí Luận văn Đánh giá một số dõng löa chọn lọc thế hệ R3, R4 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU. . 9
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 11
1.1. Giới thiệu về cây lúa . 11
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại. . 11
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lúa. 11
1.1.3. Giá trị kinh tế 12
1.1.4. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam . 13
1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn. . 13
1.2.1. Khái niệm vê ̀ hạn . 13
1.2.2. Tác hại của hạn đối với cây lu ́ a . 14
1.2.3. Cơ sở sinh ly ́ , sinh hoa ́ và phân tử của tính chịu hạn ở cây lu ́ a 14
1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong chọn dòng tế bào. 19
1.3.1. Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào thực vật . 19
1.3.2. Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma 19
1.3.3. Các phương pháp chọn dòng tế bào . 20
1.3.4. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi . 21
1.3.5. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử các dòng được
hình thành qua nuôi cấy mô tế bào .22
1.4. Một số nghiên cứu về gen ức chế sinh tổng hợp giberellin ở cây lúa . 23
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP. 26
2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu . 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 27
2.2.1. Phương pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng . 28
2.2.2. Phương pháp hóa sinh . 28
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro . 30
2.2.4. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ . 32
2.2.4. Phương pháp sinh học phân tử . 33
2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu . 37
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 38
3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R3, R4 và giống gốc có
nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước. .39
3.2. Phân tích hóa sinh các dòng chọn lọc. 45
3.2.1. Hàm lượng protein, lipit và đường tan trong hạt các dòng chọn lọc . 45
3.2.2. Đánh giá phổ điện di protein dự trữ hạt . 46
3.2.3. Hàm lượng axit amin liên kết trong hạt 47
3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc ở thế hệ R4. 51
3.4. Phân lập và giải trình tự gen GA2ox1 ức chế sinh tổng hợp gibberellin. 60
3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của dòng chọn lọc R4.05 . 60
3.4.2. Nhân gen GA2ox1 bằng kỹ thuật PCR . 61
3.4.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmit tái tổ
hợp mang gen GA2ox1 .62
3.4.4. Tách chiết plasmit tái tổ hợp . 63
3.4.5. Kết quả đọc trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 . 66
3.4.6. So sánh trình tự nucleotit của gen GA2ox1 giữa dòng R4.05 với các giống
đã công bố .66
3.4.7. So sánh trình tự axit amin giữa dòng R4.05 với các giống đã công bố. . 68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 72
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 75
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
t gạo đã khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng MS cơ bản (Murashige andSkoog, 1962 [46]), bổ sung sucrose 1% + agar 0,8%, pH=5,8. Mật độ cấy 10-15
hạt/bình, nuôi cấy ở cƣờng độ chiếu sáng 2000lux, thời gian 10/24 giờ, nhiệt độ
25
0C. Sau 2 tuần, cắt thu lấy lá dùng ngay hay bảo quản ở tủ lạnh sâu -200C.
Tách ADN tổng số
Quy trình tách ADN tổng số từ lá lúa đƣợc cải tiến dựa theo phƣơng pháp
tách ADN của Foolad & CS., (1995) [33] có cải tiến. Dung dịch ADN tổng số đƣợc
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và bằng phƣơng pháp quang phổ hấp
thụ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ sạch của ADN
Điện di trên gel agarose
- Pha agarose 0,8% trong TBE 0,5X, đun nóng, để nguội khoảng 600C đổ vào
khuôn gel 30ml có cài lƣợc.
- Sau 30 phút tháo lƣợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0,5X ngập bảng gel 1mm.
- Lấy 2μl ADN mẫu + 3μl dye trộn đều.
- Chạy điện di: 80V, 30 phút.
- Nhuộm gel: nhuộm gel bằng Ethidium bromide 0,5μg/ml trong 10 phút, rửa sạch
bằng nƣớc.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
Đo bằng quang phổ hấp thụ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
- Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ ở bƣớc sóng
260nm/280nm.
- Cho 995μl nƣớc cất và 5μl ADN mẫu vào cuvet (hệ số pha loãng 200 lần), lắc đều
đặt vào máy đo.
Hàm lƣợng và độ sạch ADN đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng ADN (ng/ml) =50 x HSPL x OD260
Độ sạch ADN = OD 260/OD280
Trong đó: HSPL: hệ số pha loãng
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260nm
50: hằng số
OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280nm.
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì mẫu ADN đƣợc coi là đủ tiêu chuẩn
về độ sạch.
2.2.5.2. Tách dòng và đọc trình tự gen GA2ox1
Nhân gen GA2ox1 bằng PCR từ ADN genome lúa
Dựa vào thông tin của trình tự gen GA2ox1 đƣợc công bố trong trong tài liệu
của Lê Xuân Đắc [7] có mã số trên ngân hàng gen (Genbank) OSJNBa0017J22.4,
sử dụng cặp mồi EX2-3-F và EX2-3-R để nhân đoạn gen GA2ox1 trên dòng chọn
lọc R4.05.
Khuếch đại gen GA2ox1 bằng PCR
Chu kỳ nhiệt nhân gen GA2ox1 theo các bƣớc sau: 940-3 phút; 940-50 giây,
53
0
-50 giây, 72
0
-50 giây lặp lại 25 chu kỳ; 720-10 phút và lƣu giữ ở 40C (Sambrook
& Russell, 2001) [52].
Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm
- Bổ sung đệm hoà tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1μl tƣơng ứng 1mg mẫu).
- Ủ ở 500 trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút
cho gel tan hoàn toàn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột gel Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p
trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500μl dung dịch QG, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy
qua cột.
- Thêm 700μl đệm rửa (PE) vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để
loại hết PE.
- Hoà tan ADN trong 30μl–50μl H2O khử ion, khử trùng đã đƣợc làm ấm 50
0C để ở
nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút.
Gắn gen vào vector tách dòng và biến nạp vector tái tổ hợp
- Sản phẩm PCR làm sạch từ thôi gen đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT sử dụng
bộ kit pGEM – T System.
- Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng: ADN, Ligation buffer 10X,
vector pBT, T4 ligase.
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α.
- Tế bào khả biến lấy từ tủ -850C đƣợc để trong đá 15-30 phút. Sau đó, bổ sung 20μl
vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến sau đó trộn nhẹ nhàng bằng đầu
pipet. Hỗn hợp đƣợc ủ 40C trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút và sau đó ủ
4
0C trong đá 5 phút.
- Bổ sung 300μl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 370C, lắc 200v/p trong
1giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150μl - 550μl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc
có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100μM, ủ đĩa ở 370C trong 16
giờ.
Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc trên
môi trƣờng thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100μM, ủ đĩa ở
37
0C trong 16 giờ sẽ thu đƣợc các khuẩn lạc xanh trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng
của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-F1/pUC18-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
R1(có trình tự bắt cặp mồi trên vector và cách nhau khoảng 0,2kb). Thành phần
phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng
và mẫu ADN thay bằng khuẩn lạc. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose
1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmit nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những
khuẩn lạc này trong 3 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l nhằm
mục đích tách plasmit.
Tách Plasmit
- Tách plasmit đƣợc sử dụng đệm chiết TELT: 0,5M Tris-HCl pH=7,5; 0,5M EDTA
pH=8,0; 1M LiCl; Trion X-100.
- Thành phần dung dịch lysozym: lysozym; 0,5M Tris-HCl pH=7,5; 0,5M EDTA
pH=8,0.
Quy trình:
- Chọn 3 khuẩn lạc trắng riêng rẽ, nuôi trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50mg/l
ampicillin qua đêm ở 370C.
- Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000v/p
trong 7 phút, loại dịch.
- Bổ sung 200μl TELT, 10μl lysozym, khuấy tan để khuẩn tan hết.
- Để nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 950 trong 3 phút, ủ 40C trong 5 phút, ly tâm
13000v/p trong 15 phút.
- Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng
isopropanol, ly tâm 13000v/p trong 15 phút.
- Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 70%.
- Làm khô plasmit bằng máy Speed Vac.
- Hoà tan Plasmit trong 40 ml nƣớc cất khử ion khử trùng.
- Bổ sung 0,1μl RNase, ủ ở 370C trong 2 giờ.
- Tinh sạch plasmit để đọc trình tự.
Quy trình tinh sạch plasmit
- Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu : VPB = 1 : 5, mix nhẹ.
- Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, li tâm 13000v/p trong 1 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
- Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch đệm rửa. Cho cột tinh sạch vào ống
eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 30μl nƣớc khử ion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2phút, ly tâm 13000v/p
trong 1 phút.
Phương pháp xác định trình tự nucleotit
Trình tự gen GA2ox1 đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing, dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Sanger có sử dụng các
dideoxiribonucleotit. Kết quả đọc trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm DNAstar
và BioEdit.
Phương pháp xử lý trình tự gen thu được
Việc so sánh và xử lý trình tự gen GA2ox1 đƣợc tiến hành theo trình tự sau:
- So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xuôi và đầu ngƣợc để xác định trình tự
đầy đủ và đúng của gen.
- BLAST trình tự đầy đủ của gen với các trình tự gen trong NCBI để xác định gen
đƣợc tách dòng là của GA2ox1.
- Giải mã trình tự nucleotit sang trình tự axit amin theo một khung đọc mở.
- Lập bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền của các trình tự
nucleotit của các dòng gen t...