hermione_1010
New Member
Download Chuyển gen qua con đường tế bào, Vectơ dùng bổ sung gen miễn phí
NỘI DUNG
2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào
2.3.4.1 Việc sử dụng tế bào tế bào toàn năng và thế hệ của chimaerae
2.3.4.2 Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính
2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen
2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất
2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại
2.3.5.3 Vector transposon
2.3.5.4 Vectơ Retroviral
2.3.5.5 Vectơ bổ sung
Để tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho
Tóm tắt nội dung:
ản của cơ thể lai, do bộ gen từ hai sinh vật đang ở trong cùng một tế bào sau quá trình thụ tinh.Dòng tế bào tế bào toàn năng đã được thiết lập ở chuột. Các dòng tế bào có nguồn gốc từ phôi sớm được gọi là tế bào ES (tế bào gốc phôi thai).
Các tế bào tế bào toàn năng thu được từ tuyến sinh dục của bào thai được gọi là các tế bào EG (tế bào phôi mầm). Các tế bào toàn năng là dòng tế bào đầu tiên được bắt nguồn từ một teratocarcinoma (một dạng u ác tính ở tinh hoàn) và do đó được gọi là EC (tế bào phôi ung thư biểu mô). Các tế bào EC có thể tham gia vào sự phát triển của phôi chimaeric nhưng không tham gia sự hình thành giao tử.
Chỉ có một số lượng nhỏ dòng tế bào ES có thể sử dụng. Tất cả đều là tế bào gốc thu được từ một hay hai dòng chuột. Pluripotency có thời gian tồn tại rất ngắn. Các tế bào Tế bào toàn năng có công suất cao để nhân giống in vitro nhưng chúng tự phát sinh những điểm khác biệt và trở thành các tế bào multipotent (tế bào đa chức năng). Điểm khác biệt của các tế bào tế bào toàn năng lá ở chỗ có thể tham gia vào sự phát triển của phôi ở một mức độ nào đó nhưng không thể trở thành giao tử. Do đó các tế bào ES phải được duy trì ở trạng thái tế bào toàn năng trong suốt toàn bộ quá trình nhằm tạo ra các động vật chimaeric có khả năng di truyền gen của chúng cho con cháu.
Các pluripotency của các tế bào ES được duy trì bằng cách thêm vào những nhân tố của môi trường tự nhiên. Đã có rất nhiều nỗ lực nhằm tạo ra dòng tế bào ES từ dòng chuột khác và từ các loài khác nhưng không thành công. Tốt nhất, nên thu nhận từ những động vật không phát sinh phôi. Hiện chưa rõ tại sao dòng tế bào ES chỉ có thể được bắt nguồn từ hai dòng chuột. Bất kỳ nguyên nhân nào, những dòng này xuất hiện hiếm khi xuất hiện những trường hợp ngoại lệ và thực tế là tế bào toàn năng tế bào không thể được duy trì trong quá trình này được coi là bình thường.Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy những quan điểm này cần xem xét lại. Những tế bào Tế bào toàn năng có khả năng truyền các gen của chúng cho con cháu đã được mô tả trên gà và medaka. Vẫn còn quá sớm để khẳng định các tế bào này tương đương với dòng tế bào ES ở chuột.
DNA bên ngoài có thể được bổ sung vào các tế bào ES và quá trình nuôi dưỡng các gen này có thể được thiết lập bằng cách sử dụng một gen lựa chọn. Các tế bào này có thể được được sử dụng để tạo ra chuột biến đổi gen chimaeric.
Phương pháp này ít hơn nhiều khó khăn và kém hiệu quả hơn vi tiêm. Đó là lý do nó chỉ được sử dụng để thay thế bằng các gen tương đồng tái tổ hợp (hình 2,10)
Hình 2.10
Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính
Những DNA ngoại sẽ được thêm vào những tế bào khác bằng phương pháp chuyển vị. Những tế bào chứa gen cần quan tâm có thể được nhân giống vô tính bởi một gen được chọn. Những tế bào này sau đó có thể là nguồn nhân cho những dòng động vật vô tính sẽ được chuyển gen. ( Hình 2.11)
Quá trình sinh sản của Dolly được theo dõi sớm bởi phương pháp chuyển gen vô tính trên cừu tên là Polly ( Schnieke và cộng sự, 1997 ).
Hình 2.11
Ưu điểm của phương pháp nối gen là nó dễ dàng được nhân rộng. Có thể sử dụng số lượng cừu ít hơn từ 2 đến 5 lần so với phương pháp vi tiêm để tạo ra số lượng cừu chuyển gen tương ứng. Gen hợp nhất có thể được khảo sát trong tế bào trước khi chuyển nhân vào . Những tế bào có gen ngoại bị thay đổi hay có nhiều bản sao sẽ bị loại bỏ. Giới tính động vật hay kiểu hình của gen cho sẽ được chọn ra. Những động vật không thích hợp sẽ không được sử dụng cho quá trình chuyển gen. Mặc dù nhân dòng vô tính là kỹ thuật khó, nhưng nó đem đến tính linh hoạt trong các thí nghiệm. Những tế bào cho nhân có thể được làm đông và được sử dụng trong chuyển gen vô tính ở động vật.
Đoạn gen thay thế được thu nhận từ cừu (McCreath và cộng sự, 2000) trên chuột (Rideout và cộng sự, 2000) và trên heo (Lai và cộng sự, 2002; Butler, 2002). Phương pháp này rất phức tạp và khó kiểm soát. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự tái tổ hợp của hai gen đồng chức năng có thể được thu nhận từ tế bào cừu nhưng những động vật được sinh sản vô tính này thường bị chết (Denning và cộng sự, 2001). Sự thất bại của việc này có thể là do quá trình nuôi dưỡng và vì vậy cần có sự lựa chọn thích hợp hơn để quá trình tái tổ hợp tương đồng có thể xảy ra . Điều kiện môi trường nuôi dưỡng làm thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào từ đó làm giảm khả năng sống của các dòng tế bào động vật mà vẫn chưa hiểu được nguyên nhân. Một sự hiểu biết tốt hơn về hiện tượng này là cần thiết trước khi có thể chuyển gen vào các động vật lớn với tỷ lệ thành công cao.
Điều này cũng đúng với chuột. Mặc dù sự thay thế gen bởi chimaeric vẫn còn khó khăn nhưng nó vẫn còn đơn giản hơn phương pháp tạo dòng vô tính.
2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen
2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất
Trong hầu hết các trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng những mảnh vụn vectơ có chứa khoảng 1 hay 2 gen, hay chuẩn bị những gen chức năng được cấu tạo từ các thành tố khác nhau. Mảnh vụn của các vectơ mang trên mình những vùng được sao lại đúng thứ tự sau khi tách ra từ đoạn sớm. Thật vậy, cả 1 vòng vectơ kết hợp chậm hơn là 1 đoạn ngắn, không những thế, cả 1 chuỗi plasmid thường gây cản trở hay thậm chí là tiêu hủy quá trình kết hợp chuyển gen. Điều này đúng với cả 5 loại vectơ: plasmid, cosmid, thể thực khuẩn, BAC và YAC. Tuy nhiên, một số nghiên cứu của sinh viên lại cho kết quả trái ngược với BAC, loại vectơ mà cả vòng có khả năng kết hợp tốt hơn 1 mảnh thuộc vòng. Nói cách khác, vectơ tồn trữ 1 đoạn gen dài ít bị phá vỡ bởi các tác động tĩnh của chuỗi tế bào prokaryote. Điều này dễ dẫn tới việc xuất hiện các tác nhân cô lập trong những đoạn gen dài hay xảy ra các hiệu ứng khoảng cách.
Những đoạn DNA không chứa các chuỗi vòng thực hiện liên kết tương đối chậm. Và vì một số nguyên nhân chưa được làm rõ, một số DNA được thêm vào mang đến cho chúng ta 1 số lượng lớn những loài động vật chuyển gen hơn là những DNA cùng loại khác. Một mặt, những DNA này có thể được sinh ra bởi sự xuất hiện của những chuỗi có khả năng nhận dạng các đoạn gen thường gặp trong đoạn thêm vào. Mặt khác, vài đoạn được nối có thể chứa những chuỗi thiên về sao chép, và sự hiện diện của chúng trong phôi hỗ trợ đáng kể cho quá trình liên kết.
2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại
Cơ chế của quá trình tích hợp được mô tả ở mục 2.3. dẫn đến phát hiện sự lien quan giữa những trình tự của đoạn chêm vào và trong bộ gen. Sự kết hợp này thường nên được tối ưu hóa bằng sự có mặt của cả 2 bộ ba kết thúc, mà 1 nằm trong đoạn chêm được sao chép 1 cách gần như hoàn chỉnh từ bộ gen ban đầu, ngay cả khi chúng bị làm cho kém đi hay thoái hóa hơn.Từ một số thí nghiệm, ta thấy điều này là đúng. Ở bò, 1 trình tự xu...