phuonganh1202
New Member
Download miễn phí Tiểu luận Kỹ thuật gen
Vectơbiểu hiện gen là những vectơtách dòng mang các promoter mạnh, cho
phép biểu hiện đồng thời cảgen chỉthịvà gen tách dòngtạo nên các protein lai.
Vectơbiểu hiện mạnh là các vectơcó đặc điểm: có khảnăng tạo sốlượng lớn
bản sao trong tếbào chủ; promoter hoạt động mạnh, dịch mã tạo nhiều protein lai;
đoạn trình tựMCS có nhiều vịtrí cắt đặc hiệu của nhiều loại enzim giới hạn; các
vectơvẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng kích thước lớn; hoạt động
của vectơkhông gây ảnh hưởng hay ức chếtếbào chủ; gen chỉthịdễdàng nhận
biết.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
200vòng/phút qua đêm ở 370C, li tâm với tốc độ 5000vòng /phút trong 5-6 phút thu
sinh khối.
Phá vỡ tế bào, sáu đó xử lý natri axetat và li tâm 12000 vòng/phút trong vòng 10
phút. Sau khhi li tâm lớp dịch nổi phía trên chứa DNA plasmid, thu lớp dịch nổi và
chuyển sang ống khác thêm ethanol 100% lạnh để kết tủa DNA plasmid.
Li tâm 14000 vòng trong vòng 10-15 phút, thu tủa DNA plasmid hoà trong nước khử
ion hay dung dịch TE, sau đó kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di hay quang phổ kế.
1.3. Tách chiết RNA toàn phần và mRNA
* Nguyên tắc chung. Phân tử RRN không bền dễ bị phân huỷ bởi các enzim
ribonuclease và các enzim này thì có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính rất cao và rất bền
vững với các tác nhân thường dung để loại enzim. Do vậy việc tách chiết RNA đòi
hỏi rất thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm từ ribonuclease từ môi trường, thao tác
phải trong điều kiện vô trùng.
* Tách RNA toàn phần. Gồm ba bước cơ bản như tách chiết DNA.
Bước 1: Tế bào và mô được nghiền trong dung dịch hỗn hợp chất tẩy mạnh và
tách protein lien kết ra khỏi RNA.
Bước 2: Loại bỏ protein khỏi mẫu qua xử lí phenol chlorophorm và li tâm.
Bước 3: Tủa RNA hoà tan trong pha nước bằng etanol và li tâm để thu nhận lại.
Mai Văn Thuận – K18 Sinh
3
* Tách chiết mRNA. 90 -99% RNA tổng số trong tế bào là tRNA, rRNA các loại
RNA này có kích thước và trình tự xác định nên có thể tách riêng bằng điện di và li
tâm. Riêng mRNA chiếm từ 1- 5% có kích thước và trình tự vô cùng đa dạng song
chúng có một điểm chung là có đuôi poliA nhờ đó có thể tách nó riêng ra nhờ sắc kí
ở trên cột OligodT- cellulose.
1.4. Các phương pháp tinh sạch axit nucleic.
* Siêu li tâm. Khi siêu li tâm dung dịch thì từ miệng ống đến đáy ống sẽ hình
thành dải gradien nồng độ, các chất có khối lượng phân tử tương ứng với từng lớp
trên gradient nồng độ. Vì vậy có thể tách được các phân tử khác nhau chỉ một
nucleotit.
* Sắc ký. Có thể trên giấy, thạch, nhựa với mục đích tách riêng các chất không
lẫn với nhau.
1.5. Định lượng và định tính axit nucleic
1.5.1. Định lượng bằng quang phổ kế
- Không thật chính xác nhưng cho phép uớc lượng nồng độ axit nucleic có trong
dung dịch dáp ứng được nhu cầu nghiên cứu.
- Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ ánh sang tia tử ngoại bước song 260nm của
các bazo purin và pirimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu
đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic có trong mẫu dựa vào sự tương quan sau:
Một đơn vị 260nm tương ứng với nồng độ 50µg/ml dung dịch DNA sợi kép,
tương ứng với 40µg/ml dung dịch DNA sợi đơn và RNA.
Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch axiy nucleic tinh sạch. Để kiểm
tra độ tinh sạch của dung dịch người ta đo thêm bằng đơn vị OD280, ở đó các
protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sang ở 260nm
như các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một
dung dich axit nucleic được coi là sạch nếu tỷ lệ OD260/OD280 =1,8- 2.
1.5.2. Phương pháp điện di
- Là phương pháp nghiên cứu sự chuyển động của các điện tích trong điện
trường ổn định.
- Nguyên tắc: Dựa vào cấu trúc của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm
đồng đều trên khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của một điện trường thì chúng sẽ
di chuyển về phía cực dương. Tính linh động của phân tử trong bản gel dưới tác
động của điênj trường được tính bằng công thức LogU = LogU0 – Kr.C. Trong đó
LogU là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng; Kr là hệ số làm chậm do
Mai Văn Thuận – K18 Sinh
4
cấu trúc của gen đồng thời nó cũng phụ thuộc vào khối lượng phân tử của axit
uclêic; C là nồng độ của gen. Như vậy tính linh động phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là
khối lượng phân tử của axit nucleic và nồng độ của gen.
2. Enzim giới hạn.
2.1 Khái niệm.
Enzim giới hạn (Restriction Ezyme – RE) là các ezim thuộc nhóm endonuclease
có khả năng nhận biết các trình tự nucleotit đặc hiệu trên phân tử DNA ( khoảng 4-8
nucleotit), cắt đặc hiệu phân tử DNA ở những vị trí nhất định thành những đoạn
ngắn.
Căn cứ vào khả năng nhận biết và vị trí cắt đặc hiệu DNA, người ta chia ezim
giới hạn thành ba nhóm
Nhóm 1 gồm các ezim giới hạn nhận biết trình tự nucleotit, sau đó trượt lên phía
trước cắt ở vị trí nhận biết khoảng 1000- 5000 nucleotit.
Nhóm 2 gồm các enzim giới hạn nhận biết các trình tự nucleotit đặc hiệu và cắt
ngay tai vị trí nhận biết, các enzim này có vai trò quan trọng trong kỹ thuật gen
Nhóm 3 gồm các enzim giới hạn nhận các trình tự nucleotit đặc hiệu và cắt ở
cách vị trí nhân biết khoảng 20 nucleotit về phía trước.
Enzim giới hạn không mang tính đặc hiệu loài.
2.2 Tên gọi của enzim giới hạn.
Tên gọi của các enzim được thống nhất ký hiệu 3 -5 chữ cái, kèm theo các số La
Mã. Chữ cái đầu tiên viết hoa chỉ tên chi của vi khuẩn đã tách triết được enzim, hai
chữ cái tiếp theo viết thường chỉ loài hay giống của sinh vật đã tách chiết enzim
giới hạn, chữ cái tiếp theo viết hoa chỉ tên chủng vi khuẩn đã chiết được enzim giới
hạn. Ví dụ, EcoRI.
2.3 Các kiểu cắt của enzim giới hạn.
Tuỳ đặc điểm từng loại enzim giới hạn, đoạn DNA cắt có đầu bằng hay đầu so
le.
- Enzim giới hạn cắt cả hai mạch DNA cùng một điểm tạo các đoạn cắt có đầu
bằng, các đoạn cắt không có khả năng tự dính lại với nhau để nối các đầu bằng cần
sử dụng enzim nối ligase hay các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzim.
- Các loại enzim giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí khác nhau
giữa hai mạch đơn, tạo nên các đoạn cắt có đầu so le hay đầu dính. Các đầu so le
này có khả năng tự nối lại với nhau. Enzim cắt giới hạn đầu so le gồm có hai loại:
Các enzim cắt đầu so le 5’là enzim giới hạn cắt phân tử DNA, tạo nên mạch đơn
Mai Văn Thuận – K18 Sinh
5
DNA có đầu 5’dài hơn mạch đơn đầu 3’. Các enzim cắt tạo đầu so le 3’cuối là
enzim giới hạn cắt phân tử DNA, tạo nên mạch đơn DNA có đầu 3’ dài hơn mạch
đơn đầu 5’.
3. Các loại enzim thường sử dụng trong kỹ thuật gen.
Trong kỹ thuật gen, ngoài các enzim giới hạn còn sử dụng nhiều loại enzim khác
nhau, trong đó các loại enzim xúc tác tổng hợp DNA, enzim nối DNA và các enzim
thủy phân DNA, RNA có vai trò rất quan trọng.
Mỗi loại enzim có đặc tính khác nhau, có hoạt tính cao trong những điều kiện
thích hộ nhất định. Do vậy tùy theo mục đích của nghiên cứu và điều kiện cụ thể
của phòng thí nghiệm để lựa chọn các loại enzim thích hợp, có hiệu quả cao trong
nghiên cứu.
3.1. Enzim xúc tác tổng hợp DNA, RNA.
Nhóm này gọi chung là DNA polymerase, gồm rất nhiều loại khác nhau có vai
trò xúc tác gắn các nucleotit mới vào chuỗi mạch đơn DNA đang tổng hợp.
3.2. Enzim nối DNA.
Enzim DNA ligase là loại enzim xúc tác hình thành các liên kết photphoeste nối
các đoạn DNA với nhau. Mỗi loại enzim DNA ligase có các tính chất đặc trưng
riêng, có khả năng nối các đoạn DNA đầu bằng hay đầu so le.
3.3. Các loại enzim phân cắt axit nucleic.
Các loại enzim c