Download miễn phí Đề tài Nghiên cứu thay thế chủng nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật bản
Hiện nay một vài công nghệvăcxin tái tổhợp đang được nghiên cứu. Potein E và
preM của virut VNNB được tách chiết từcác plasmit tái tổhợp đã tạo ra kháng thể
ƯCNKHC và kháng thểtrung hòa, thửnghiệm trên chuột được bảo vệ đầy đủvới 2 liều
văcxin. Cấu trúc của protein E và preM sinh miễn dịch tối ưu, phần tái tổhợp bên ngoài
tếbào có chứa protein E và preM và ngưng kết tố. Đồng tổng hợp preM và E có thểrất
quan trọng đểtạo ra các thành phần với quyết định kháng nguyên E và preM đểbảo vệ,
vấn đềnày thật phù hợp và đúng đắn [88, 86, 89, 97, 105, 154,156, 157, 169, 191, 195].
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
-1 BIKEN, Nhật Bản- Tá chất Freund adjuvant incomplex Sigma, Mỹ
- Tá chất Freund adjuvant complex Sigma, Mỹ
- Gel DEAE sephacel AP Biotech
- HRPO Sigma, Mỹ
- Ortho-Phenylene-Diamine OPD Sigma, Mỹ
- Sodium periodate (NaIO4) Sigma, Mỹ
- Sodium tetrahydridoborate (NaBH4) Sigma, Mỹ
- Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma, Mỹ
- Sodium acetate (CH3COONa) BDH, Anh
- Potassium chloride (KCl) BDH, Anh
- Di-sodium hydrogen orthophosphate (Na2HPO4) BDH, Anh
- Sodium di-hydrogen orthophosphate (NaH2PO4) Osi, Pháp
- Sulfuric Acid (H2SO4) Sigma, Mỹ
- Hydrogen Peroxide (H2O2) Merck, Đức
49
- Acetic Acid (CH3COOH) Osi, Pháp
- Axit citric (H3C6H5O7) Osi, Pháp
1.4 Hóa chất dùng cho kiểm định chất lượng và chế tạo bộ sinh phẩm định lượng
kháng nguyên ELISA
Tên hóa chất Hãng sản xuất Tên hóa chất Hãng sản xuất
- Môi trường MEM Difco - Natri sulfat khan Gibco
- Lactalbumin hydrolysat (LH) Difco - Axit tricloracetic Gibco
- Trypsin Difco - Folin Gibco
- Cao nấm men (Yeast extract) Difco - Đồng sulfat Gibco
- Hexamethylen tetramin Difco - Gelatin Sigma
- Albumin bò (BA) Sigma - Acetylaceton Sigma
- Huyết thanh Bê (CS) Sigma - Amoni acetat Sigma
- Huyết thanh bê bào thai Sigma - Axit acetic Sigma
- Đỏ trung tính Sigma - Dithizon Sigma
- Glucose Sigma - Carbon tetraclorit Sigma
- Na-Glutamat Sigma - Erythromicin Sigma
- EDTA-2Na Gibco - Vicillin Sigma
- Agar Noble Gibco - Fungizon Sigma
- Đỏ phenol Gibco
1.5 Các loại màng lọc
- Màng Nylon mesh Thái Lan
- Màng lọc vô trùng Millipore các cỡ 0,22, 0,45, 1,2 và 5,0µm Mỹ
- Màng siêu lọc pellicon cassette 10.000Mw; 100.000Mw Mỹ
1.6 công cụ plastic sử dụng một lần
- Bơm tiêm 1, 2, 5, 10 và 20ml Terumo
- Pipet 1, 2, 5, 10 và 20ml Nunc
- Chai nuôi tế bào 25, 50 và 100ml Nunc
- Hộp lồng đường kính 6cm Nunc
50
- Bản ELISA (marcisorp surface) Nunc, Mỹ
- Tube ly tâm 100ml, 1000ml Hitachi, Kubota
- Tube siêu ly tâm 90ml Hitachi
- Đầu tip cho pipet man 20; 100; 200 và 1000µl Nunc, Mỹ
1.7 công cụ thủy tinh trung tính
- Cốc 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000ml Schott, Đức
- Phiễu lọc đường kính 10, 15 và 20cm Schott, Đức
- Ống đong 100, 250, 500, 1000 và 2000ml Schott, Đức
- Chai 100, 200, 500, 1000, 5000, 10000 và 20000ml Schott, Đức
- Pipet 1, 3, 5, 10ml Nunc, Mỹ
- Bình cầu khía 250ml Schott, Đức
- Cóng thủy tinh thạch anh Schott, Đức
- Lọ 5ml, nút cao su và nút nhôm NeoCap, Indonesia
1.8 Các công cụ khác
- Pipett man 20, 100, 200 và 1000µl Eppendorf, Đức
- Pipett bừa (multichanel pipette) 200µl Eppendorf, Đức
- Pipette Aid (Drummond) Eppendorf, Đức
- Kim gặt não đường kính 2mm Việt Nam
- Băng chỉ thị màu sấy khô, hấp ướt 3M, Mỹ
- Pince Kocher Đức
- Pince phẫu thuật có mấu Đức
- Kéo phẫu tích các cỡ Đức
- Kéo mổ mắt Đức
- Bơm tiêm Cornwall Mỹ
- Găng cao su dùng một lần Việt Nam
- Các công cụ tiêu hao dùng trong phòng thí nghiệm (quần áo vô trùng, găng, bông,
gạc, nút cao su các cỡ, khay men, khay nhựa, khay nhôm, giá để tube các loại...)
- Các công cụ văn phòng phẩm
2 Thiết bị
Tên thiết bị Nước sản xuất
- Hotte Laminaire (lọc thổi không khí vô trùng) Pháp
- Máy nghiền não Nissei (5000ml) Nhật Bản
51
- Máy ly tâm lạnh dung tích lớn (6000ml ; 7000v/p) Mỹ, Nhật Bản
- Máy siêu ly tâm 65000G; rotor RP42 Nhật Bản, Mỹ
- Hệ thống lọc vô trùng millipore 10l, 20l và giá lọc Φ42,9 Mỹ
- Tủ ấm CO2 Nhật Bản
- Tủ ấm Nhật Bản
- Tủ lạnh -80oC, -20oC và 4oC Nhật Bản
- Bain marie (nồi đun cách thủy) Đức
- Máy hút chân không Nhật Bản
- Thùng nitơ lỏng (giữ giống virut và tế bào) Pháp
- Máy khuấy từ AIK Đức
- Máy đo pH Pháp
- Máy cất nước 1 lần, 2 lần và 3 lần Mỹ
- Máy quang phổ Nhật Bản
- Cân phân tích Đức
- Cân điện Pháp, Mỹ
- Lò sấy khô Đức
- Lò hấp ướt Pháp
- Và các thiết bị khác
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Quy trình công nghệ sản xuất giống virut VNNB chủng Beijing-1 (đảm bảo nhiệt
độ 2-80C trong suốt quy trình gặt)
Tên chủng gốc Beijing-1 (đã tiêm truyền não chuột 42 đời)
Nơi cung cấp NIID, Nhật Bản
Tên giống gốc tại VABIOTECH : Bei(42)2 (tiêm truyền não chuột ổ 2 đời, sử
dụng làm chủng gốc (master seed), sau đó tiêm truyền chuột 11-13g để làm chủng sản
xuất (working seed).
52
Sơ đồ gây nhiễm và gặt não vô trùng, sản xuất chủng gốc (MS)
Chủng Beijing-1 (NIH, Nhật Bản)
Tiêm não chuột 0,01ml/con (107PFU/ml)
Thu thập chuột ốm và liệt giờ 72
Cắt tim, rửa 10 lần trong nước đá
Rửa bằng cồn 1 phút
Rửa 4 lần nước cất
Thấm khô bằng gạc vô trùng
Xếp và cố định chuột vào khay
Sát trùng vùng đầu bằng cồn Iod 1%
Mổ lấy não vô trùng từng con
Bảo quản não trong cối sứ 40C
(sau đó nghiền vô trùng ngay)
53
Tóm tắt sơ đồ nghiền đồng nhất, sản xuất chủng gốc (MS)
Tổng trọng lượng não chuột ổ
Nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8,0
Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC
Lọc nước nổi qua Nylon mesh
Loại tủa
Xử lý protamin sulfate 1%
Khuấy từ 30 phút ở 4oC
Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC
Lọc nước nổi qua Nylon mesh
Loại tủa
Lọc vô trùng: millipore 0,45-1,2-5,0µm
Thêm gelatin 0,02%
Mẫu thử: - Vô trùng
- PFU
- LD50
Đóng lọ 2ml/lọ
Dán nhãn: tên chủng, ngày sản xuất...
Bảo quản trong Nitơ lỏng
54
3.2 Qui trình công nghệ sản xuất chủng sản xuất (BWS)
Tiêm não chuột 0,03ml/con (107PFU/ml)
Thu chuột liệt giờ thứ 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90
Cắt tim, rửa 10 lần trong nước đá
Rửa bằng cồn 1 phút
Rửa 4 lần nước cất
Máy rung khô chuột
Xếp và cố định chuột vào khay
Gặt não vô trùng (dùng áp lực chân không)
Bảo quản não trong –80oC
Chủng gốc Beijing-1: Bei (42)2
Chuột swiss 3 tuần tuổi
55
Tổng trọng lượng não chuột
Nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH 8,0
Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC
Lọc nước nổi qua Nylon mesh
Loại tủa
Xử lý protamin sulfate 1%
Lọc nước nổi qua Nylon mesh
Lọc vô trùng: millipore 0,45-1,2-5,0µm
Thêm gelatin 0,02%
Mẫu thử: - Vô trùng
- PFU
- LD50
Đóng lọ 6ml/lọ
Dán nhãn: tên chủng, ngày sản xuất...
Bảo quản trong Nitơ lỏng
Khuấy từ 30 phút ở 4oC
Ly tâm 5000v/p x 50phút ở 4oC
Loại tủa
56
3.3 Quy trình công nghệ sản xuất văcxin VNNB từ chủng Beijing-1
3.3.1 Gây nhiễm, thu thập chuột liệt và gặt não chuột
Thu hoạch não vô trùng qua hệ thống hút chân không, 200 não cho 1 hộp lồng
(inox hay plastic đường kính 100mm).
Sau mỗi lần thu hoạch cần cất ngay vào –80oC để giữ hiệu giá virut được ổn định.
Giống sản xuất (WS)
Tiêm chuột Swiss 11-13g (IC 0,03ml/con)
Pha giống 107PFU
Loại bỏ chuột chết trước 65 giờ sau tiêm
Thu thập chuột liệt đủ tiêu chuẩn Loại bỏ chuột chết
Xử lý sạch
vô trùng
Gặt não
vô trùng
Bảo quản
–80oC
giờ 67 (5h) x-v
giờ 85 (23h) x-v
giờ 70 (8h) x-v
giờ 82 (20h) x-v
giờ 79 (17h) x-v
giờ 76 (14h) x-v
giờ 73 (11h) x-v
giờ 88 (2h) x-v
giờ 101 (14h) x-v
giờ 98 (11h) x-v
giờ 92 (5h) x-v
giờ 95 (8h) x-v
giờ 104 (17h) x-v
giờ 107 (20h) x-v
57
3.3.2 Nghiền não đồng nhất 20% trong PBS, văcxin bán thành phẩm thô
Tổng số não
Tổng trọng lượng
Nghiền não đồng nhất trong PBS
pH 8,0. 7000 v/p trong 15’, ở 4oC
Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC
Thu nước nổi (NN)
Xử lý với protamin sulfate
Ly tâm 5000 v/p x 50’, ở 4oC
Thu nước nổi (NN1)
Loại tủaNghiền lại lần 2
Ly tâm 5000 v/p
trong 50’, ở 4oC Loại tủa
Thu nước nổi
Tủa protamin
sulfate
Loại tủaLy tâm 5000 v/p trong 50’, ở 4oC
Thu NN (NN2)
Hộn NN1 + NN2
Lọc qua Nylon mesh
Lọc vô trùng Millipore
(0,45, 1,2 và 5,0µm)
Lấy mẫu thử: - Vô trùng
- PFU
...