fatdragon31
New Member
Download Luận văn So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà ri, gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài . 1
2. Mục tiêu của đề tài . 2
3. Nội dung nghiên cứu . 2
Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM . 3
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU . 4
1.2.1. Gà Ri . 4
1.2.2. Gà Mông . 4
1.2.3. Gà Sao . 5
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI . 6
1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng . .6
1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể . .8
1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể . .8
1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà . .9
1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà . 12
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới . 12
13.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam . 15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
2.1. VẬT LIỆU . 17
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ . 17
2.2.1. Hóa chất . 17
2.1.2. Thiết bị . 18
2.3. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19
2.3.1. Các phương pháp hóa sinh . 19
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ . 19
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô . 19
2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số . 19
2.3.1.4. Định lượng Protein. . 20
2.3.1.5. Phương pháp xử lý số liệu . 21
2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử . 22
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật . 22
2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose . 23
2.3.2.3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR . 24
2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen . 26
2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA . 28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
3.1. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ . 29
3.1.1. Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tươi . 29
3.1.2. Hàm lượng vật chất khô . 30
3.1.3. Hàm lượng lipit tổng số . 31
3.1.4. Hàm lượng protein tổng số . 32
3.2 . ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ . 34
3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà . 34
3.2.2. Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể . 36
3.2.3. Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể . 39
3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop . 39
3.3.2.2. Xác định trình tự vùng D-loop của DNA ty thể . 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 51
Kết luận. . 51
Đề nghị .52
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 53
PHỤ LỤC . 57
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
natricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha
trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2.
Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);
Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl
(0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide.
Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma.
Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g;
Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g. Dẫn nước đến 100ml.
Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);
EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%.
Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH;
EDTA (0,5mM, pH8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…).
Bộ hóa chất CloneJET TM PCR Cloning của hãng Fermentas
Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing.
Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC.
- Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II
(Sol II); Dung dịch III (Sol III).
2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm
hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và
Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học.
Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC Sanyo, Nhật Bản
Máy li tâm Sorvall
Máy đo pH Mettler, Anh
Lò vi sóng Samsung, Hàn Quốc
Cân phân tích Metter Toledo, Thụy Sỹ
Pipetman các loại Gilson, Pháp
Máy điện di PowerPac 300, Mỹ
Máy PCR - PTC100 MJ Research, Mỹ
Máy làm khô chân không Speed Vac Sc 110A-Savan, Mỹ
Máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ
Máy khuấy trộn OSI, Rotolab
Máy xác định trình tự tự động
ABI PRISM
TM
3100 Genetic Analyser
Applied Biosystems, Mỹ
Máy Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems, Mỹ
Bể ổn nhiệt Tempette Junior Tech
Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ
Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số
liệu trên máy vi tính.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước
Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử
rồi cho vào tủ sấy ở 60oC trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới
khi khối lượng không đổi.
Hàm lượng nước được tính theo công thức: N =
100t k
t
P P
P
%
Trong đó: N: Hàm lượng nước (%)
Pt: Khối lượng mẫu tươi (g)
Pk: Khối lượng mẫu khô (g)
2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số
Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và
cân trọng lượng đầu và cuối [13].
Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete,
benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu.
Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào
tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy
Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần.
Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định
để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở
nhiệt độ 4oC trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh
độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết,
soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy
khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức:
L =
100
A B
A
%
Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%)
A: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g)
2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry)
Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và
protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc
trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.
Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để
tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên
trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol,
pirimidin, axit uric, các ion kim loại hay các hợp chất chứa nhóm - SH, các
axit tự do Tyr, Trp. hay cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có
mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn
1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung
dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung
dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng
khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hay giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này
không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm.
Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi
ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30'
đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm.
Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin
Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch
protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được
dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml.
Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng
protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm
lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức:
% protein =
%100
g
Pa
Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ
P: hệ số pha loãng (200)
g: số mg mẫu cần phân tích
2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi
tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số:
Giá trị trung bình
X
n
X
X
n
1i
i
Độ lệch chuẩn
X
S
)30(
1
)30(
1
2
1
2
n
n
XX
S
n
n
XX
S
n
i
i
X
n
i
i
X
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Sai số trung bình
X
m
)30(
1
)30(
n
n
S
m
n
n
S
m
X
X
X
X
2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật
Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài
nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ
proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối
cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Quy trình kỹ thuật
Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia
máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA
t
Download miễn phí Luận văn So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà ri, gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài . 1
2. Mục tiêu của đề tài . 2
3. Nội dung nghiên cứu . 2
Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM . 3
1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU . 4
1.2.1. Gà Ri . 4
1.2.2. Gà Mông . 4
1.2.3. Gà Sao . 5
1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI . 6
1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng . .6
1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể . .8
1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể . .8
1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà . .9
1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà . 12
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới . 12
13.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam . 15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
2.1. VẬT LIỆU . 17
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ . 17
2.2.1. Hóa chất . 17
2.1.2. Thiết bị . 18
2.3. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19
2.3.1. Các phương pháp hóa sinh . 19
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ . 19
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô . 19
2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số . 19
2.3.1.4. Định lượng Protein. . 20
2.3.1.5. Phương pháp xử lý số liệu . 21
2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử . 22
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật . 22
2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose . 23
2.3.2.3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR . 24
2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen . 26
2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA . 28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
3.1. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ . 29
3.1.1. Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tươi . 29
3.1.2. Hàm lượng vật chất khô . 30
3.1.3. Hàm lượng lipit tổng số . 31
3.1.4. Hàm lượng protein tổng số . 32
3.2 . ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ . 34
3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà . 34
3.2.2. Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể . 36
3.2.3. Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể . 39
3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop . 39
3.3.2.2. Xác định trình tự vùng D-loop của DNA ty thể . 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 51
Kết luận. . 51
Đề nghị .52
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 53
PHỤ LỤC . 57
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung:
O3 2% trong NaOH, dung dịch B CuSO4 0,5% trongnatricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha
trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2.
Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);
Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl
(0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide.
Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma.
Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g;
Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g. Dẫn nước đến 100ml.
Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);
EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%.
Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH;
EDTA (0,5mM, pH8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…).
Bộ hóa chất CloneJET TM PCR Cloning của hãng Fermentas
Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing.
Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC.
- Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II
(Sol II); Dung dịch III (Sol III).
2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm
hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và
Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học.
Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC Sanyo, Nhật Bản
Máy li tâm Sorvall
Máy đo pH Mettler, Anh
Lò vi sóng Samsung, Hàn Quốc
Cân phân tích Metter Toledo, Thụy Sỹ
Pipetman các loại Gilson, Pháp
Máy điện di PowerPac 300, Mỹ
Máy PCR - PTC100 MJ Research, Mỹ
Máy làm khô chân không Speed Vac Sc 110A-Savan, Mỹ
Máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ
Máy khuấy trộn OSI, Rotolab
Máy xác định trình tự tự động
ABI PRISM
TM
3100 Genetic Analyser
Applied Biosystems, Mỹ
Máy Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems, Mỹ
Bể ổn nhiệt Tempette Junior Tech
Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh
2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ
Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số
liệu trên máy vi tính.
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước
Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử
rồi cho vào tủ sấy ở 60oC trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới
khi khối lượng không đổi.
Hàm lượng nước được tính theo công thức: N =
100t k
t
P P
P
%
Trong đó: N: Hàm lượng nước (%)
Pt: Khối lượng mẫu tươi (g)
Pk: Khối lượng mẫu khô (g)
2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số
Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và
cân trọng lượng đầu và cuối [13].
Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete,
benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu.
Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào
tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy
Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần.
Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định
để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở
nhiệt độ 4oC trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh
độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch.
Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết,
soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy
khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức:
L =
100
A B
A
%
Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%)
A: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g)
2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry)
Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và
protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc
trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời
có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm.
Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để
tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên
trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol,
pirimidin, axit uric, các ion kim loại hay các hợp chất chứa nhóm - SH, các
axit tự do Tyr, Trp. hay cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có
mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn
1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung
dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung
dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng
khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hay giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này
không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm.
Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi
ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30'
đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm.
Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin
Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch
protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được
dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml.
Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng
protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm
lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức:
% protein =
%100
g
Pa
Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ
P: hệ số pha loãng (200)
g: số mg mẫu cần phân tích
2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi
tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số:
Giá trị trung bình
X
n
X
X
n
1i
i
Độ lệch chuẩn
X
S
)30(
1
)30(
1
2
1
2
n
n
XX
S
n
n
XX
S
n
i
i
X
n
i
i
X
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Sai số trung bình
X
m
)30(
1
)30(
n
n
S
m
n
n
S
m
X
X
X
X
2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật
Nguyên tắc chung
Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài
nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ
proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối
cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.
Quy trình kỹ thuật
Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia
máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA
t