Download miễn phí Khóa luận Tìm hiểu quy trình định HCV bằng kỹ thuật Real-Time PCR
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT . .i
DANH MỤC HÌNH ẢNH . ii
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
CHƯƠNG MỞ ĐẦU . iv
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C
1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan .2
1.1.1. Giới thiệu chung . . .2
1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan C .2
1.2. Dịch tể học .3
1.2.1.Tình hình nhiễm siêu vi C tại thế giới .3
1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C trên Việt Nam .5
1.3. Con đường lây nhiễm . 5
1.4. Triệu chứng lâm sàng . . . .6
1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị.7
1.5.1. Biện pháp phòng ngừa . .8
1.5.2. Điều trị . .8
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN SIÊU VI C
2.1. Giới thiệu . . . 11
2.2. Cấu trúc - đặc điểm . 12
2.2.1. Protein cấu trúc . .12
2.2.2. Protein không cấu trúc . . .13
2.3. Cơ chế gây bệnh .13
2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập tế bào chủ . .14
2.3.2. Nhiễm HCV cấp . .14
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C
3.1. Chẩn đoán lâm sàng .17
3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan . .17
3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan . 17
3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát . . 17
3.1.4. Sinh thiết tế bào gan .17
3.1.5. Xét nghiệm miễm dịch học . .17
3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng 18
3.2.1. Phương pháp bDNA . .18
3.2.2. Phương pháp ELISA . .18
3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh . .19
3.2.4. Kỹ thuật Hybrid . .20
3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR . .20
CHƯƠNG 4: QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT ĐỊNH LƯỢNG HCV
4.1. Kỹ thuật Real-Time PCR .23
4.1.1. Nguyên tắc . .23
4.1.2. Các thành phần của phản ứng Real-Time PCR .24
4.1.3. Các kiểu phản ứng Real-Time PCR . 25
4.1.4. Khái niệm chu kỳ ngưỡng . . 28
4.1.5. Thiết kế đường cong chuẩn . . .29
4.1.6. Tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR . . .30
4.2. Quy trình thực hiện . . .33
4.3. Thuyết minh quy trình . .34
4.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu . . .34
4.3.2. Thu nhận RNA . . .35
4.3.3. Quy trình thực hiện . . .35
4.3.4. Thực hiện phản ứng RT . 35
4.3.5. Thực hiện phản ứng Real-Time PCR . . .36
4.4. Đọc và giải thích kết quả . 44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN .45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác.2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập vào tế bào vật chủ
Các bước sao chép được mô tả như sau :
PProtein màng của E2 giúp gắn kết virus vào tế bào.
P Sự cởi bỏ vỏ ngoài của HCV.
P Quá trình dịch mã và xử lý protein.
P Sự tổng hợp RNA HCV mạch âm nhờ RNA polymerase được mã hóa trong vùng NS5B.
P Tổng hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới. Quá trình này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase.
P Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương.
P Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 1012 virion HCV mỗi ngày.
2.3.1.1. Nhiễm HCV cấp
HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hay tiếp xúc với dịch cơ thể người mang HCV. HCV có thể lưu hành tự do trong huyết tương và gây nhiễm các tế bào di động như lympho bào, bạch cầu đơn nhân. Ngoài ra, bằng phương pháp lai in situ, PCR và các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang đã tìm thấy các thành phần virus trong tế bào gan, các tế bào lympho B và T, và các đại thực bào, và hóa học mô miễn dịch đã chứng minh các kháng nguyên virus trong các tế bào thượng bì đường mật và trong các tế bào thượng bì tuyến nước bọt. Việc phát hiên này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng :
-Việc nuôi cấy siêu vi C có thể thực hiện được ở các dòng lympho bào.
- Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn chứa siêu vi và đặc biệt có thể là nguyên nhân gây tái nhiễm siêu vi C sau khi ghép gan.
- Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài biến chủ đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dái.
-RNA virus thường được phát hiện 2 ngày sau truyền nhiễm, tuy nhiên không liên tục, cho thấy có các đơn bùng cháy sau chép virus. Khi được xác định bằng định lượng PCR và bằng xét nghiệm DNA nhánh, tình trạng huyết tương tăng lên mức độ cao (180 bộ gene/ml hay nhiều hơn) trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.
Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến 1,72g/ml. Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khác nhau : hay là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diện với mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03) ; hay là ở dạng kết hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hay hiện diện trong các phức hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao.
2.3.1.2. Nhiễm HCV mạn
Nhiễm HCV thường có 80% tình trạng virus có trong huyết thanh tồn tại, cho dù không có các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa. Lượng virus trong huyết thanh được phát hiện trong quá trình tồn tại biến đổi thay đổi theo từng cá nhân, từ 102 – 1010 gene/ml, và có thể dao động mạnh theo thời gian. Tình trạng virus huyết thanh có lúc không phát hiện được đánh giá là do dao động về số lượng tế bào nhiễm virus, các yếu tố vật chủ tác động lên sự thanh thải virus cũng như hiệu quả sao chép của các loài.
CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C
3.1. Chẩn đoán lâm sàng
3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan
Định lượng các men AST (Alanin Amino Transferase ) và ALT (Aspartate Amino Transferase). Đặc điểm quan trọng về phương diện sinh hóa trong viêm gan siêu vi C là sự dao động của men ALT lúc tăng, lúc giảm thậm chí trong giới hạn bình thường. Sự tăng men gan trong viêm gan C cấp thường thấp hơn so với mức tăng trong viêm gan A và B.
3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan
Chức năng bài tiết mật bị ảnh hưởng dẫn đến tình trạng tăng bilirubin trong máu ( cả bilirubin trực tiếp và bilirubin giáp tiếp) gây vàng da. Bilirubin là sản phẩm chuyển hoá của hemoglobin. Bilirubin gián tiếp và bilirubin trực tiếp thường được đo để tầm soát và theo dõi bệnh gan hay đường mật.
Đánh giá chức năng tổng hợp yếu tố đông máu của gan bằng cách khảo sát
Prothrombine bình thường 8,2-10,3
Taux de prothrombin bình thường lớn hơn 80%.
INR bình thường 0,9-1,3.
Đánh giá chức năng tổng hợp Albumin màu của gan. Trị số trung bình Albumin trong máu từ 35-55 g/l và tỷ số Albumin/Globulin bình thường từ 1-1,5. Albumin là protein quan trọng nhất của huyết thanh tham gia vào hai chức năng chính : duy trì áp lực thẩm thấu keo trong huyết tương và liên két vận chuyển phân tử nhỏ như : acid béo, bilirubin… Globulin chủ yếu là immunoglobulins (Ig's)- có nhiều lọai, IgM, IgE...) được tạo ra từ bạch cầu, thuộc về kháng thể và có chức năng nhận ra và "tấn công" các vật lạ xâm nhập cơ thể.
Chức năng thải NH3 bình thường là 9-33µmol/L. Khi gan suy NH3 sinh độc cho cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh dẫn đến rối loạn tri giác, hôn mê.
3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát
Giúp chẩn đoán loại trừ các nghuyên nhân gây tắc mật khác như sỏi mật, u đường mật, u đầu tụy, hay các tổn thương như ung thư gan, sán lá gan…
Trong viêm gan cấp, cấu trúc gan đồng nhất, gan có thể hơi to.
Sinh thiết tế bào gan : quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ viêm nhiễm chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị.
3.1.4. Xét nghiệm miễn dịch học
Tìm anti-HCV trong máu.
Tuy nhiên xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tình trạng nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu và không thể kết luận chắc chắn là không còn mang HCV.
3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
3.2.1. Phương pháp bDNA
Là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA HCV với những probe bắt cặp bổ sung với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa. Đây là một phương pháp phát hiện và định lượng trực tiếp. Người ta xử lý huyết tương hay huyết thanh người bệnh với protease K nhằm giải phóng RNA HCV từ các hạt virus. RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó phức hợp RNA HCV-probe được cố định trên một vi giếng và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang sẽ được thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng.
Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai loại probe ( probe cố định RNA HCV vào vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV ) phải được thiết kế sao cho có thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Các loại probe này thường có kích thước từ 16-24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) vào khoảng 700C nhằm đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng lai và tín hiệu tối đa.
Phương pháp cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh có nồng độ RNA HCV từ 200000 đến 120000000 phân tử RNA/1ml máu. Các genotype của HCV cũng có ảnh hưởng trên việc định lượng RNA HCV giữa genotype 1 và 2 có độ nhạy chênh lệch nhau vào khoảng 3 lần và giữa genotype 3a và 6a là 1,5 lần.
3.2.2. Phương pháp ELISA
Phương pháp này sử dụng nguyến tắc phát hiện phân tử lai dựa vào sự chuyển màu cơ chất hay tín hiệu quang, hóa quang dưới sự xúc tác của enzyme k...