cobengocxit_yumi
New Member
Download Luận văn Ứng dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố
Trong luận văn này, chúng tôi ứng dụng những quy trình, bộkit PCR dựa trên
kết quảcác công trình xây dựng quy trình PCR đã công bốtrên thếgiới, trong nước
và phương pháp nuôi cấy đểkhảo sát sựhiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong
nhóm thực phẩm đường phốbao gồm các nhóm: kem, sữa và nước giải khát trên địa
bàn TP. HCM. Từ đó đưa ra kết luận vềtình hình vệsinh an toàn thực phẩm đường
phốtrên địa bàn TP. HCM hiện nay so với tiêu chuẩn của BộY tế(QĐ-BYT,
04/1998) đối với nhóm thực phẩm đường phố ởnước ta hiện nay.
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
của sự lai phân tử là sự tách rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ
môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) và sự tái bắt cặp trở lại giữa hai mạch
khi nhiệt độ được giảm từ từ. Một trong hai mạch DNA bổ sung (thường là DNA
mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hay nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự tái
bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự bổ sung có thể là
DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử lai DNA-DNA hay DNA-RNA
[10].
Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA
trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực
ion của môi trường.
1.3.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên
khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và
một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA đó [8], [11]. Kỹ thuật này do Karl
Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử
dụng rộng rãi để phát hiện, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các vi sinh vật có trong thực
phẩm.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tất cả các DNA polymerase đều cần
những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn. Mạch khuôn
thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho
loài vi sinh vật mục tiêu hay là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên
biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này
được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch
khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA,
ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng
bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có
thể thấy được vạch của DNA sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide [3], [7], [8].
Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần có những thông tin tối
thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo
được cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một
mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen.
Ngoài các phương pháp không truyền thống trên, hiện nay còn sử dụng một số
phương pháp thử nhanh khác như:
+ Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ: nhằm tách các tế bào vi sinh vật mục tiêu
với các tế bào vi sinh vật khác, bằng cách sử dụng những hạt có từ tính cao được bao
bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu [8], [17]. Các hạt này
giúp hấp phụ chọn lọc các vi sinh vật mục tiêu và giữ chúng lại trênbờ mặt các hạt từ
và tách chúng ra khỏi các quần thể vi sinh vật khác [8], [12].
+ Kỹ thuật màng Petri (Petrifilm): kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng
dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của
kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời hạn sử dụng lâu
và không cần hấp khử trùng môi trường [8].
+ Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (Conductance/ impedance): kỹ thuật này
nhằm phát hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa trên sự tăng độ dẫn điện của môi
trường do sản phẩm trao đổi chất có tính ion được tiết vào môi trường bởi vi sinh vật.
Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về
độ dẫn điện được ghi nhận bởi các thiết bị đo, nhờ vậy giúp phát hiện các vi sinh vật
trong môi trường nuôi cấy [8], [24].
1.3.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp
- Phương pháp truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh được xem là
phương pháp chuẩn và đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm và
các trung tâm phân tích. Tuy nhiên, việc phát hiện bằng phương pháp này tốn nhiều
thời gian (5 - 7 ngày), tốn kém và mất nhiều công sức [8].
- Phương pháp ELISA có ưu điểm và độ nhạy cao, nhưng độ đặc hiệu lại thấp,
do có thể hình thành các phản ứng chéo không đặc hiệu giữa các chủng khác nhau,
phương pháp này đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các
protein trong thực phẩm. Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh
trường hợp cho kết quả âm tính giả [58].
- Phương pháp lai phân tử và phương pháp PCR đang được ứng dụng nhiều
nhất hiện nay. Phương pháp lai dùng mẫu dò không đánh dấu bằng phóng xạ (được
khuyến cáo sử dụng) chỉ phát hiện được vi sinh vật ở mức 106 - 108 tế bào/g mẫu.
Trong khi đó, thông thường độ nhạy của phản ứng PCR có thể là 1 - 10 tế bào/g mẫu
[23], [68].
Nhìn chung, so với các phương pháp hiện đại đã đề cập trên, phương pháp
PCR có một số ưu điểm sau:
+ Thời gian cho kết quả nhanh: phương pháp PCR có thể phát hiện vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm trong khoảng 1 - 2 ngày, trong khi đó, phương pháp nuôi cấy
truyền thống là 5 - 7 ngày [8].
+ Thao tác đơn giản, có thể phân tích những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi
cấy tăng sinh đơn giản không cần qua giai đoạn tăng sinh chọn lọc.
+ Hoá chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm, dễ bảo quản. Không sử dụng nhiều
môi trường nuôi cấy phức tạp như phương pháp nuôi cấy [4].
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR cao do nguyên tắc phát hiện
dựa trên kiểu gen chuyên biệt của từng vi sinh vật đích [7].
Hiện nay, phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự
nhiên ĐHQG TP. HCM đã chuyển giao các quy trình và bộ kit PCR xét nghiệm các
vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm với giá 30.000 VND, với giá thành này có thể
cạnh tranh với các phương pháp khác [57].
Chính vì những ưu điểm trên mà phương pháp PCR đang ngày càng được sử
dụng rộng rãi trong các xét nghiệm vi sinh.
1.4. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR vào việc kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1. Lịch sử ra đời kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR được Kary Mullis người Mỹ phát minh vào năm 1985 và
được thừa nhận chính thức từ năm 1993, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào
tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến
của Mullis phát triển và đã được sử dụng tại nhiều nước trên toàn thế giới, trong
nhiều lĩnh vực [57], chẳng hạn:
+ Vân tay di truyền [54]
+ Kiểm tra huyết thống [55]
+ Chẩn đoán bệnh di truyền [57]
+ Tách dòng gene [60]
+ Gây đột biến điểm [54]
+ Phân tích mẫu DNA cổ [67]
+ Xác định kiểu gene của các đột biến [62]
+ Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật [70]
+ So sánh mức độ biểu hiện của gene [65],…
1.4.2. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trên thế giới
Từ khi ra đời vào năm 1985, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng kỹ thuật
PC...
Download miễn phí Luận văn Ứng dụng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố
Trong luận văn này, chúng tôi ứng dụng những quy trình, bộkit PCR dựa trên
kết quảcác công trình xây dựng quy trình PCR đã công bốtrên thếgiới, trong nước
và phương pháp nuôi cấy đểkhảo sát sựhiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong
nhóm thực phẩm đường phốbao gồm các nhóm: kem, sữa và nước giải khát trên địa
bàn TP. HCM. Từ đó đưa ra kết luận vềtình hình vệsinh an toàn thực phẩm đường
phốtrên địa bàn TP. HCM hiện nay so với tiêu chuẩn của BộY tế(QĐ-BYT,
04/1998) đối với nhóm thực phẩm đường phố ởnước ta hiện nay.
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Tóm tắt nội dung:
gen đặc trưng của vi sinh vật qua quá trình lai. Cơ sởcủa sự lai phân tử là sự tách rời hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ
môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm ) và sự tái bắt cặp trở lại giữa hai mạch
khi nhiệt độ được giảm từ từ. Một trong hai mạch DNA bổ sung (thường là DNA
mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hay nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự tái
bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung. Các trình tự bổ sung có thể là
DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử lai DNA-DNA hay DNA-RNA
[10].
Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA
trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực
ion của môi trường.
1.3.2.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên
khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và
một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA đó [8], [11]. Kỹ thuật này do Karl
Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử
dụng rộng rãi để phát hiện, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các vi sinh vật có trong thực
phẩm.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là: tất cả các DNA polymerase đều cần
những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn. Mạch khuôn
thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho
loài vi sinh vật mục tiêu hay là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên
biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này
được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch
khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA,
ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng
bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có
thể thấy được vạch của DNA sau khi nhuộm bằng Ethidium bromide [3], [7], [8].
Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần có những thông tin tối
thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo
được cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một
mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen.
Ngoài các phương pháp không truyền thống trên, hiện nay còn sử dụng một số
phương pháp thử nhanh khác như:
+ Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ: nhằm tách các tế bào vi sinh vật mục tiêu
với các tế bào vi sinh vật khác, bằng cách sử dụng những hạt có từ tính cao được bao
bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu [8], [17]. Các hạt này
giúp hấp phụ chọn lọc các vi sinh vật mục tiêu và giữ chúng lại trênbờ mặt các hạt từ
và tách chúng ra khỏi các quần thể vi sinh vật khác [8], [12].
+ Kỹ thuật màng Petri (Petrifilm): kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng
dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của
kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời hạn sử dụng lâu
và không cần hấp khử trùng môi trường [8].
+ Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (Conductance/ impedance): kỹ thuật này
nhằm phát hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa trên sự tăng độ dẫn điện của môi
trường do sản phẩm trao đổi chất có tính ion được tiết vào môi trường bởi vi sinh vật.
Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về
độ dẫn điện được ghi nhận bởi các thiết bị đo, nhờ vậy giúp phát hiện các vi sinh vật
trong môi trường nuôi cấy [8], [24].
1.3.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp
- Phương pháp truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh được xem là
phương pháp chuẩn và đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm và
các trung tâm phân tích. Tuy nhiên, việc phát hiện bằng phương pháp này tốn nhiều
thời gian (5 - 7 ngày), tốn kém và mất nhiều công sức [8].
- Phương pháp ELISA có ưu điểm và độ nhạy cao, nhưng độ đặc hiệu lại thấp,
do có thể hình thành các phản ứng chéo không đặc hiệu giữa các chủng khác nhau,
phương pháp này đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các
protein trong thực phẩm. Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh
trường hợp cho kết quả âm tính giả [58].
- Phương pháp lai phân tử và phương pháp PCR đang được ứng dụng nhiều
nhất hiện nay. Phương pháp lai dùng mẫu dò không đánh dấu bằng phóng xạ (được
khuyến cáo sử dụng) chỉ phát hiện được vi sinh vật ở mức 106 - 108 tế bào/g mẫu.
Trong khi đó, thông thường độ nhạy của phản ứng PCR có thể là 1 - 10 tế bào/g mẫu
[23], [68].
Nhìn chung, so với các phương pháp hiện đại đã đề cập trên, phương pháp
PCR có một số ưu điểm sau:
+ Thời gian cho kết quả nhanh: phương pháp PCR có thể phát hiện vi sinh vật
trong mẫu thực phẩm trong khoảng 1 - 2 ngày, trong khi đó, phương pháp nuôi cấy
truyền thống là 5 - 7 ngày [8].
+ Thao tác đơn giản, có thể phân tích những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi
cấy tăng sinh đơn giản không cần qua giai đoạn tăng sinh chọn lọc.
+ Hoá chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm, dễ bảo quản. Không sử dụng nhiều
môi trường nuôi cấy phức tạp như phương pháp nuôi cấy [4].
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR cao do nguyên tắc phát hiện
dựa trên kiểu gen chuyên biệt của từng vi sinh vật đích [7].
Hiện nay, phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự
nhiên ĐHQG TP. HCM đã chuyển giao các quy trình và bộ kit PCR xét nghiệm các
vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm với giá 30.000 VND, với giá thành này có thể
cạnh tranh với các phương pháp khác [57].
Chính vì những ưu điểm trên mà phương pháp PCR đang ngày càng được sử
dụng rộng rãi trong các xét nghiệm vi sinh.
1.4. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR vào việc kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1. Lịch sử ra đời kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR được Kary Mullis người Mỹ phát minh vào năm 1985 và
được thừa nhận chính thức từ năm 1993, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào
tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến
của Mullis phát triển và đã được sử dụng tại nhiều nước trên toàn thế giới, trong
nhiều lĩnh vực [57], chẳng hạn:
+ Vân tay di truyền [54]
+ Kiểm tra huyết thống [55]
+ Chẩn đoán bệnh di truyền [57]
+ Tách dòng gene [60]
+ Gây đột biến điểm [54]
+ Phân tích mẫu DNA cổ [67]
+ Xác định kiểu gene của các đột biến [62]
+ Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật [70]
+ So sánh mức độ biểu hiện của gene [65],…
1.4.2. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trên thế giới
Từ khi ra đời vào năm 1985, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng kỹ thuật
PC...