il0ve_hackiNg
New Member
Download miễn phí Luận văn Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM) 3
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt 4
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính 5
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) 6
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) 6
1.2. Khử nitrate nhờ vi khuẩn 7
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 8
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan 9
1.5. Ảnh hưởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn nước sinh hoạt 12
1.5.1. Ảnh hưởng của nitrate đến sức khỏe con người 12
1.5.2. Ảnh hưởng của thừa sắt đến sức khỏe con người 14
1.6. Ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 15
1.7. Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại được sử dụng trong các nghiên cứu về tính đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn 15
1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 15
1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 16
1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 17
Chương 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu 18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.1.2. Hóa chất 18
2.1.3. Thiết bị, công cụ sử dụng trong nghiên cứu 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 21
2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate 23
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn 23
2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phương pháp ARDRA 24
2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE 25
2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 27
2.2.7. Phương pháp FISH 27
2.2.8. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate 29
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trường sinh thái khác nhau 33
3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) 34
3.3. Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu bằng phương pháp FISH 36
3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu 37
3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 38
3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate bằng phương pháp ARDRA 40
3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn thay mặt 43
KẾT LUẬN 49
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 62
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
màu của môi trường hay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trường hợp khác nhau (USDA, 2008; Downes và Ito, 2001).Môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tương ứng với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nước) hay nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1). Thí nghiệm MPN được tiến hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hay trầm tích trong môi trường khoáng nước ngọt hay nước lợ, thí nghiệm được tiến hành với 3 dãy pha loãng, mẫu được đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần. Sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi trường từ trắng đục (màu của Fe(II)) sang vàng nâu (màu của Fe(III)).
2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate
ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển được sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần tương tự như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel và Bak, 1992). ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược đầu tại 28oC trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ).
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn
DNA tổng số của mẫu bùn và trầm tích từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cs, 1996 mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm:100 mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM Đệm phosphate (Na2HPO4 /NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Trộn 2 ml mẫu làm giàu từ ống MPN với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol (chịu dung môi). Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần. Bổ sung 40 μl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC. Thêm 600 μl SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. Trộn đều kỹ với lượng tương đương PCI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, trộn đều kỹ với lượng tương đương CI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở -20oC.
DNA genome của chủng đơn được tách theo phương pháp của Marmur (1961). 1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 - 10000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8). Thêm 50 μl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 50 μl SDS (20%) và 50 μl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ. Thêm 400 μl PCI, trộn đều trong 1- 3 phút, ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 400 μl CI, trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút tại 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đã để lạnh -20oC), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ. Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA. Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh -20oC) trong 1 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl MQ vô trùng (hay đệm TE) và bảo quản tại -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).
2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phương pháp ARDRA
ARDRA được sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng enzyme giới hạn (Ravenschlag và cs, 1999). Gen 16S rDNA (xấp xỉ 1500 bp) của các chủng đơn được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 3.
Bảng 3. Phản ứng PCR gen 16S rDNA.
Thành phần phản ứng
Thể tích (μl)
Nhiệt độ (oC)
Thời gian
Số chu kỳ
H2O MQ
13,5
94
3 phút
10x buffer
2,5
94
30 giây
35
BSA (3 mg/ml)
2,5
55
45 giây
MgCl2 (20 mM)
2
72
1,5 phut
dNTP (2,5 mM)
2
72
7 phút
Mồi 27F (50 pmol/μl)
0,5
Mồi 1492R (50 pmol/μl)
0,5
Taq polymerase (5u/μl)
0,5
DNA Khuôn
1
Tổng thể tích phản ứng
25
Gen 16S rDNA sau khi khuếch đại được xử lý bằng hai enzyme giới hạn MspI và HaeIII (Fermentas) (bảng 4). Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút. Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp nhóm dựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di.
Bảng 4. Phản ứng cắt gen 16S rDNA bằng các enzym giới hạn MspI và HaeIII.
Nước cất vô trùng
18 μl
10x đệm R (hay đệm Tango)
2 μl
Sản phẩm PCR
10 μl (0,1 - 0,5 μg DNA)
Enzym HaeIII (hay MspI) (Fermentas)
1 μl (10 u/μl)
Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37oC trong 3 giờ
2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE
Hình 7. Vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillus plantarum.
Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (hình 7) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer và cs, 1993). “Touch-down” PCR (bảng 5) được sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ. Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) được gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F.
Bảng 5. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE.
Thành phần phản ứng
Thể tích (μl)
Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR
H2O MQ
27
Taq polymerase được đưa vào phản ứng sau bước biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi được đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút.
10x Taq buffer
5
BSA (3 mg/ml)
5
MgCl2 (20 mM)
4
dNTP (2,5 mM mỗi loại)
4
Mồi GM5F-GC (50 pmol/μl)
1
Mồi 907R (50 pmol/μl)
1
DNA khuôn
2
Taq polymerase (5 u/μl)
1
Tổng thể tích phản ứng
50
DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formami...