xuan_phong
New Member
LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này.
Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.
Giáo trình sinh học phân tử này cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên với các nội dung chính sau:
- Cấu trúc và chức năng của gen
- Cấu trúc genome
- Các quá trình tái bản, phiên mã và dịch mã của nguyên liệu di truyền - Điều hòa biểu hiện gen
- Sửa chữa và bảo vệ gen
- Tái tổ hợp và chuyển gen
Do mới được xuất bản lần đầu nên giáo trình này khó tránh khỏi thiếu sót hay chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc. Vì thế, chúng tui mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn.
Chương 1
I. Nucleic acid
Cać đaị phân tử sinh học
Nucleic acid, vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành tư các monomer là nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường 5 carbon) và một nitrogen base. Các nitrogen base thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine (A) và guanine (G), các pyrimidine gồm thymine (T), cytosine (C) và uracil (U). Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài.
Nucleicacidgồmhailoạiphântửcócấutạorât́giôńgnhaulàdeoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA).
1. Deoxyribonucleic acid
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn là một chuỗi nucleotide (Hình 1.1). Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường deoxyribose và môṭ trong bôń base (A, C, G và T) (Hình 1.2). Hai sợi đơn kêt́ hợp với nhau nhờ các liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai sợi: A bổ sungchoTvàCbổsungchoG.Môĩsợiđơncómôṭtriǹhtựđiṇhhướngvớimôṭđâù 5’phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ →3’). Hướng của hai sợi đơn trong chuôĩ xoăń keṕ ngược nhau, nên được gọi là hai sợi đối song.
Những phân tích cấu trúc hiện đại đã cho thấy cấu trúc của DNA không phải luôn luôn tương ứng với dạng được gọi là B mà Watson và Crick đã đưa ra. Do sự tác động của các hợp chất có khối lượng nhỏ hay protein, dạng B có thể chuyển sang dạng A (nén nhiều hơn) hay là dạng Z (xoắn trái). Chúng có thể tự gấp lại hay xoắn mạnh, ví dụ một sợi đôi DNA có độ dài là 20 cm được nén trong một chromosome có kích thước là 5 μm.
Hình 1.1. Chuỗi xoắn kép của DNA
Phân tử DNA trong nhiễm sắc thể của sinh vật eukaryote ở dạng mạch thẳng, còn ởphầnlớntếbàoprokaryote(vikhuân̉)phântửDNAlạicódạngmạchvòng.Tuy nhiên, dù ở dạng nào thì các phân tử DNA này đều tồn tại theo kiểu cuộn chặt. Trong tế bào eukaryote, DNA kết hợp chặt chẽ với các protein là histone.
DNA eukaryote có kích thước rất lớn (Ví dụ: DNA ở người có thể dài đến 1 m) nên vấn đề đặt ra là phân tử này phải được nén như thế nào trong một thể tích rất hạn chế của nhân. Việc nén được thực hiện ở nhiều mức độ, mức độ thấp nhất là nucleosome vàmứcđộcaonhât́làcâútrućnhiêm̃săćchât́.Thâṭvâỵ,đườngkińhcuảchuôĩxoăń
DNAchỉlà20,trongkhisợinhiêm̃săćchât́quansat́dướikińhhiên̉viđiêṇtửcó đường kính 100 , đôi khi đạt 300 . Điều này chứng tỏ phân tử DNA tham gia hình
thành những cấu trúc phức tạp hơn (Hiǹ h 1.3).
Sợi nhiễm sắc chất có đường kính 100 là một chuỗi chứa nhiều nucleosome.
ĐólànhữngcâútrućhiǹhthaǹhtưmôṭsợiDNAquâńquanhmôṭloĩgôm̀8phântử histone (mức độ tổ chức cao nhât́ cuả DNA). Sợi có đường kính 100 này có cấu trúc
phứctap̣ hơnsợicóđườngkińh300 .Trongnhântếbào,cácsợivưakểtrênkếthợp chặt chẽ với nhiều protein khác nhau và cả với các RNA tạo thành nhiễm sắc chất, mức độ tổ chức cao nhất của DNA.
Hình 1.2. Cấu trúc các nucleotide điển hình
Hình 1.3. Cấu trúc nucleosome và nhiễm sắc thể. Phân tử DNA được cuộn lại trên nhiễm sắc thể làm cho chiều dài ngắn lại hơn 50.000 lần.
Các DNA ở eukaryote có đặc điểm khác với DNA prokaryote. Toàn bộ phân tử DNA prokaryote đêù mang thông tin mã hóa cho cać protein trong khi đó DNA của eukaryotebaogôm̀ nhữngtriǹhtựmãhóa(cać exon)xenkẽvớinhữngtriǹhtựkhông mã hóa (intron). Cać triǹ h tự mã hóa ở eukaryote chìm ngập trong một khối lớn DNA mà cho đến nay vẫn chưa rõ tać duṇ g được gọi là “DNA rác” (junk DNA). Tùy theo mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự DNA được chia làm ba loại:
-Cáctrìnhtưlăp̣laịnhiêùlâǹ.Vídu:̣ởđôṇgvâṭcóvúcaćtriǹhtựnaỳchiêḿ 10-15%genome(hệgen).ĐólànhữngtriǹhtựDNAngăń (10-200kb),khôngmãhóa, thườngtậptrungởnhữngvuǹgchuyênbiêṭtrênnhiêm̃săćthểnhưởvuǹgtâmđôṇg (triǹhtựCEN)hayởđâùcaćnhiêm̃săćthể(triǹhtựTEL).Chứcnăngcuảcáctrìnhtự này chưa rõ, có thể chúng tham gia vào quá trình di chuyển DNA trên thoi vô sắc (trình tựCEN)hoặcvàoquátriǹhsaochéptoànbộphầnDNAnăm̀ ởđầumútnhiễmsắcthể (triǹhtựTEL).
- Các trình tư có số lần lặp lại trung biǹ h. Ví dụ: ở genome người các trình tự này chiếm 25-40 %. Chúng đa dạng hơn và có kích thước lớn hơn (100-1.000 kb) các triǹhtựlăp̣laịnhiềulần.Cáctrìnhtựnàyphânbốtrêntoànbộgenome.Chúngcóthểlà
nhữngtriǹhtựkhôngmãhóamàcuñgcóthểlànhữngtriǹhtựmãhóachorRNA,tRNA và 5S RNA.
-Cáctrìnhtưduynhât́.Làcaćgenmãhóachocaćprotein,cótriǹhtựđăc̣trưng cho tưng gen.
Môṭ đặc điểm của phân tử DNA có ý nghĩa rất quan trọng và được sử dụng vào phương pháp lai phân tử, đó là khả năng biến tính và hồi tính. Biến tính là hiện tượng hai sợi đơn cuả phân tử DNA tać h rời nhau khi cać liên kêt́ hydrogen giữa cać base bổ sung nằm trên hai sợi bị đứt do các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm, formamide, urea) haydotácnhânvậtlý(nhiệt).Sauđo,́nêúđiêùchin̉hnhiêṭđộvànôǹgđộmuôíthićh hợp, các sợi đơn có thể băt́ căp̣ trở laị theo nguyên tắc bổ sung, để hình thành phân tử DNA ban đầu, đó là sự hồi tính.
2. Ribonucleic acid
Phân tử RNA có cấu tạo tương tự DNA ngoại trư ba điểm khác biệt sau:
- Phân tử RNA là chuỗi đơn.
- Đường pentose của phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose.
- Thymine (T), môṭ trong bôń loại base hình thành nên phân tử DNA, được thay thế bằng uracil (U) trong phân tử RNA.
Cấu trúc và chức năng của RNA có sự biến đổi rõ rệt. Về cơ bản RNA chỉ là chất mang thông tin di truyền ở virus, sau đó người ta chứng minh rằng nó không những đóng vai trò cơ bản ở việc chuyển thông tin di truyền mà còn có vai trò cấu trúc khi tạo nên phức hệ RNA-protein.
Theomôṭ lýthuyêt́ tiêń hóamàđạidiệnlàEigen,RNAlàchấtmangthôngtindi truyền, thành viên trung gian của sự biểu hiện gen, thành phần cấu tạo và là chất xúc tác. Nhóm OH ở vị trí thứ hai của ribose cần thiết cho đa chức năng làm nhiễu loạn sự tạo thành sợi đôi, qua đó làm tăng độ không bền vững của liên kết phosphodieste.
Trong tế bào có ba loại RNA chính, có các chức năng khác nhau: 2.1. Các RNA thông tin (mRNA)
mRNA là bản sao của những trình tự nhất định trên phân tử DNA, có vai trò trung tâm là chuyển thông tin mã hóa trên phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành phân tử protein tương ứng. Các RNA có cấu trúc đa dạng, kích thước nhỏ hơn so với DNA vì chỉchứathôngtinmãhóachomôṭhoăc̣vaìproteinvàchỉchiêḿkhoan̉g2-5%tôn̉gsố RNA trong tế bào.
Quá trình chuyển thông tin được thể hiện như sau:
Hình 9.10. Các vector họ pUR. Đây là các vector dung hợp với gen lacZ, có các vị trí tạo dòng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII và ClaI ở đầu 3’ của gen lacZ. Sự chèn vào của đoạn DNA ngoại lai (cDNA) trong các vị trí tạo dòng thích hợp cho phép sản xuất protein dung hợp của β-galactosidase hoạt động với chuỗi peptide được mã hóa bởi DNA ngoại lai.
3. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng
Nói chung, có ba cách thường được dùng để xác định mức độ biểu hiện protein
ngoại lai của gen được tạo dòng:
- Điện di polyacrylamide gel có SDS để xác định protein có kích thước thích hợp được sản xuất ở mức độ cao trong các tế bào mang vector biểu hiện. Thông thường, protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue hay bằng AgNO3. Nếu không thấy có băng protein mới khi dùng các thuốc nhuộm này, thì đánh dấu sự trao đổi chất với 100 μCi của [35S]Met hay [35S]Cys trên 1 mL
dịch nuôi cấy trong 5 phút. Sau đó, sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE hay phóng xạ tự ghi có thể phát hiện được protein quan tâm.
- Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện điện di SDS-polyacrylamide gel.
- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện. Như vậy, nếu sự phiên mã hay dịch mã hạn chế biểu hiện thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.
▪ Phân tích Western blot
- Kỹ thuật SDS-PAGE
Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS cho phép phân tách các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường tư cực âm sang cực dương. Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.
- Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể
Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, có thể áp dụng phản ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein. Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào động vật thí nghiệm (thỏ, chuột...) và được tinh sạch tư máu động vật sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương tác với một kháng nguyên nhất định.
Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hay bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích/chuyển thấm lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hay immunoblot) (Hình 9.11). Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase...) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.
Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western
blot. Ngoài ra, kháng thể được sử dụng để tinh sạch protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hay sắc ký ái lực (affinity chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA (Hình 9.11).
V. Phương pháp phát hiện dòng vi khuẩn có DNA tái tổ hợp 1. Lai khuẩn lạc và vết tan
DNA được tạo dòng trong plasmid hay YAC sản xuất ra các khuẩn lạc khi các nuôi cấy biến nạp được dàn mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi cấy dưới những điều kiện thích hợp. Các bacteriophage sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vi khuẩn (bacterial lawn) của lớp agar đỉnh (trong trường hợp này người ta chuẩn bị đĩa agar có hai lớp: lớp agar đỉnh có nồng độ agar thấp để bacteriophage dễ sinh tan tế bào vi khuẩn, và lớp agar đáy có nồng độ agar cao hơn).
Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp). Các chỉ thị này thường là gen kháng kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng.
Hình 9.11. Kỹ thuật Western blot và ELISA dưa trên phản ưng liên kết kháng nguyên- kháng thể
Ngoài ra, các vector còn chứa các gen chỉ thị bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng. Ví dụ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase.
Một dòng (clone) chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc hay vết tan. Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp hay vết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hay nylon bằng cách phủ (overlay) màng này lên trên đĩa agar. DNA được biến tính và cố định trên màng bằng đun nóng (baking) hay chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đã đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Ví dụ: Có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc tư genomic DNA tưng phần, cDNA hay trình tự protein hay sản phẩm PCR. Trong một vài trường hợp, probe có thể được thiết kế dựa trên trình tự bắt nguồn tư gen tương đồng của các loài khác và thường được lai với cường lực thấp. Các probe thưa được rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang. Theo hướng của phim (sau khi rửa) so sánh với đĩa agar gốc, sau đó sẽ
có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang.
2. Sàng lọc thư viện gen bằng PCR
PCR (polymerase chain reaction) cũng có thể được ứng dụng để sàng lọc các thư viện genomic DNA hay cDNA được xây dựng trong các plasmid vector hay bacteriophage vector. Ưu điểm chính của sàng lọc bằng PCR so với sàng lọc dựa trên lai truyền thống là ít tốn thời gian hơn. Sàng lọc bằng PCR có thể được đảm bảo trong 3-4 giờ trong khi đó nó có thể mất một vài ngày trước khi phát hiện bằng kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization). Kỹ thuật sàng lọc bằng PCR thể hiện chỉ thị về kích thước của các đoạn chèn DNA được tạo dòng hơn là trình tự của đoạn chèn, tuy nhiên các primer PCR đặc trưng cho đoạn chèn DNA ngoại lai cũng có thể được sử dụng. Điều này cho phép khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng tư thư viện cDNA và genomic DNA.
▪ Nguyên tắc của PCR
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot.
Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theohàmmũlênđêń haǹgtriêụ lâǹ cać đoaṇ DNAcóchiêù daìkhoảngtư200-3.000bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hay chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ,sốlượngđoạnDNAnóitrênđượcnhânlêngấpnhiêù lâǹ,nhờvậycóthểđủsố lượng để tách ra, phân tích trình tự hay tạo dòng... Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phaỉ tać động trên sợi DNA 5’-3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.12. Theo đó, tư chu kỳ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hay dài hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di.
PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó tư 10-6 μg DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 μg (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).
- Gắn primer (annealing) ở 40-65oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vịtrícótrìnhtựtươngđồngởDNAkhuônmẫu.Cácliênkếtiontaọ thaǹhmộtđoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu tư các vị trí có primer theo chiều 5’→3’.
Hình 9.12. Sơ đồ phản ưng chuỗi DNA polymerase (PCR) 3. Sàng lọc các thư viện cDNA bằng các probe khác nhau
Sàngloc̣thưviêṇcDNAbằngcáchlainucleicacidlàphươngphaṕđượcsửduṇg phổ biến và đáng tin cậy nhất để tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháplainucleicacidchophépphântíchđồngthờinhiêùdoǹgvànhanh,khôngđoìhoỉ các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hay kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác nhau có thể điều chỉnh các probe của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.
- Các probe tương đồng. Các probe tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA quan tâm. Chúng được dùng trong nhiều trường hợpkhácnhau,vídu:̣khimôṭdoǹgbộphâṇcuảcDNAhiêṇcóđượcsửduṇgđểphân lập một dòng hoàn chỉnh tư thư viện cDNA. Thông thường, đoạn bắt nguồn tư một đầu hay đầu kia của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thămdòthưviện.Laivớicać probetươngđôǹgthườngđượctiêń haǹhdướicać điêù kiện nghiêm ngặt.
-Caćprobetươngđôǹgtừngphâǹ.Cácprobetươngđôǹgtưngphâǹđược dùng để phát hiện các dòng cDNA có quan hệ họ hàng, nhưng không giống hệt nhau hoàn toàn, với các trình tự của probe.
-Cać probeoligonucleotidenhântaọ.Cácprobeoligonucleotidenhântạolàcác vùngdNTPcuảtriǹhtựxaćđiṇhđượctôn̉ghợpinvitro.Triǹhtựcuảcaćprobenaỳ được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, tư các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến của mã di truyền3, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được đoán cho triǹhtự.Măc̣du,̀trongrât́nhiêùtrườnghợp,triǹhtựcaćaminoacidgiôńgnhaucóthể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.
4. Phân tić h genomic DNA bằng phương pháp lai Southern
Việc phát hiện và xác định các chuỗi nucleic acid đặc trưng là công việc thường xuyên trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa vào sự lai phân tử, dưới các điều kiện thích hợp hai chuỗi nucleic acid đơn tạo thành một phân tử lai.Phảnứnglaiphụthuôc̣rât́nhiêùvaòmứcđộtươngđôǹgcuảhaichuôĩnucleotide. Việc tạo thành phân tử sợi đôi như thế xảy ra chủ yếu thông qua liên kết hydrogen giữa các base guanosine với cytosine, và adenosine với thymidine. Thành phần và sự phân bố củacácbasekhônggiôńgrõrêṭvớicaćphântửnucleicacidchokêt́quảcaćtińhchât́lai khác nhau, vì thế liên kết hydrogen (hay lai phân tử giữa các base tương đồng) khi đượcghépcặpthićhhợpđãcungcâṕmôṭcôngcụcógiátrịđểxaćđiṇhcaćchuôĩliên quan hay đồng nhất với chuỗi nucleic acid quan tâm (probe).
Trong số các kỹ thuật khác nhau sử dụng lai phân tử để phân tích nucleic acid, thì kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là lai mâũ dò nucleic acid được đánh dấu với nucleic acid đích được cố định trên một vật đơ rắn, đặc trưng là màng nitrocellulose hay nylon.
TriǹhtựcuảkỹthuậtlaiSouthernblotbaogồmcácbướcsau
hântáchcácđoạn cắt hạn chế của DNA hệ gen bằng điện di agarose gel, chuyển DNA tư agarose gel lên màng lai, lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng lai (Hình 9.13).
Hình 9.13. Sơ đồ của kỹ thuật lai Southern blot. Các mẫu DNA đích và genomic DNA (A) và (B) trong ví dụ này được cắt bằng EcoRI và được phân đoạn bằng điện di trên agarose gel. DNA của plasmid mang đoạn chèn DNA dùng làm mẫu dò (C) cũng được cắt bằng EcoRI và điện di như là một đối chứng dương tính.
Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu probe bằng 32P (mặc dù các đồng vị phóng xạ khác như 35S cũng có thể được sử dụng). Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của probe tối thiểu phải là 109 dpm/μg, mặc dù hoạt tính 108 dpm/μg có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không lớn. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.
VI. Các ưng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong đời sống. Các ứng dụng này bao gồm sản xuất dược phẩm và các loại hóa chất khác, các vi khuẩn đặc biệt, các cây trồng nông nghiệp quan trọng, và các vật nuôi đã được biến đổi di truyền... Kỹ thuật này cũng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm y khoa và (trong một vài trường hợp) đang được dùng để kiểm tra các khiếm khuyết di truyền ở người. Hàng trăm công ty hiện nay đang đặc biệt phát triển các sản phẩm thông qua biến đổi di truyền các cơ thể sống. Dưới đây là các ứng dụng chính của công nghệ DNA tái tổ hợp.
1. Ứng dụng trong dược phẩm
Sản phẩm thương mại đầu tiên được phát triển bằng công nghệ DNA tái tổ hợp là các dược phẩm dùng trong điều trị các bệnh và các rối loạn ở người. Năm 1979, Tổ hợp Eli Lilly bắt đầu sản xuất thương mại insulin người bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trước thời điểm này, tất cả insulin dùng trong điều trị bệnh tiểu đường được tách chiết tư tụy của các vật nuôi cho thịt. Mặc dù nguồn insulin này có tác dụng tốt cho nhiều người mắc bệnh tiểu đường, nhưng nó vẫn không phải là insulin người, và một số người đã trải qua các phản ứng phụ với protein ngoại lai. Gen insulin người sau đó đã được chèn vào plasmid và chuyển vào vi khuẩn để sản xuất insulin người. Các dược phẩm được sản xuất thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm: hormone sinh trưởng người (cho trẻ em mắc bệnh còi), nhân tố tạo tơ huyết (chữa bệnh khó đông máu), hoạt tố plasminogen mô (dùng để hòa tan các huyết khối trong bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim), interferon, interleukin, DNA vaccine...
2. Các vi khuẩn đặc biệt
Các vi khuẩn có vai trò quan trọng trong các quá trình công nghiệp, bao gồm sản xuất ethanol tư các nguyên liệu thực vật, lọc khoáng tư quặng, xử lý nước thải và các loại chất thải khác. Các vi khuẩn đang sử dụng trong các quá trình này được biến đổi di truyền bằng công nghệ DNA tái tổ hợp sao cho chúng có thể hoạt động hiệu quả hơn. Các chủng vi khuẩn mới hữu ích thu được tư kỹ thuật hiện đại này đang được phát triển để phân hủy các hóa chất độc và các chất gây ô nhiễm, tăng cường thu hồi dầu, tăng nitrogen cho cây trồng, và ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn và vi nấm gây bệnh.
3. Các sản phẩm nông nghiệp
Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng đã có một ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất nông nghiệp, nơi mà hiện nay nó được dùng để tạo ra các cây trồng và vật nuôi mang các đặc điểm có giá trị. Trong nhiều năm, các nhà bệnh học thực vật đã thưa nhận rằng thực vật bị nhiễm bệnh virus thể nhẹ sau đó sẽ kháng lại sự nhiễm trùng các chủng mang độc tính mạnh. Vì vậy, các nhà di truyền học đã tạo ra tính kháng virus trong cây trồng bằng cách chuyển các gen vỏ protein của virus vào tế bào thực vật. Cây bí (squash) biến đổi di truyền có tên là Freedom II, mang các gen của virus 2 gây bệnh khảm ở dưa hấu (watermelon mosaic virus 2) và virus gây bệnh khảm màu vàng ở cây zucchini (zucchini yellow mosaic virus) để chống sự nhiễm trùng virus.
Một hướng khác được biến đổi di truyền đó là tính kháng sâu (pest) ở thực vật đã làm giảm sự phụ thuộc vào các thuốc trư sâu hóa học. Độc tố protein tư vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã giết một cách chọn lọc các ấu trùng của các sâu bọ côn trùng nhất định nhưng lại không gây độc cho sự sống của các động vật hoang dã, người và
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này.
Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.
Giáo trình sinh học phân tử này cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên với các nội dung chính sau:
- Cấu trúc và chức năng của gen
- Cấu trúc genome
- Các quá trình tái bản, phiên mã và dịch mã của nguyên liệu di truyền - Điều hòa biểu hiện gen
- Sửa chữa và bảo vệ gen
- Tái tổ hợp và chuyển gen
Do mới được xuất bản lần đầu nên giáo trình này khó tránh khỏi thiếu sót hay chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc. Vì thế, chúng tui mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn.
Chương 1
I. Nucleic acid
Cać đaị phân tử sinh học
Nucleic acid, vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành tư các monomer là nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường 5 carbon) và một nitrogen base. Các nitrogen base thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine (A) và guanine (G), các pyrimidine gồm thymine (T), cytosine (C) và uracil (U). Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài.
Nucleicacidgồmhailoạiphântửcócấutạorât́giôńgnhaulàdeoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA).
1. Deoxyribonucleic acid
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn là một chuỗi nucleotide (Hình 1.1). Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường deoxyribose và môṭ trong bôń base (A, C, G và T) (Hình 1.2). Hai sợi đơn kêt́ hợp với nhau nhờ các liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai sợi: A bổ sungchoTvàCbổsungchoG.Môĩsợiđơncómôṭtriǹhtựđiṇhhướngvớimôṭđâù 5’phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ →3’). Hướng của hai sợi đơn trong chuôĩ xoăń keṕ ngược nhau, nên được gọi là hai sợi đối song.
Những phân tích cấu trúc hiện đại đã cho thấy cấu trúc của DNA không phải luôn luôn tương ứng với dạng được gọi là B mà Watson và Crick đã đưa ra. Do sự tác động của các hợp chất có khối lượng nhỏ hay protein, dạng B có thể chuyển sang dạng A (nén nhiều hơn) hay là dạng Z (xoắn trái). Chúng có thể tự gấp lại hay xoắn mạnh, ví dụ một sợi đôi DNA có độ dài là 20 cm được nén trong một chromosome có kích thước là 5 μm.
Hình 1.1. Chuỗi xoắn kép của DNA
Phân tử DNA trong nhiễm sắc thể của sinh vật eukaryote ở dạng mạch thẳng, còn ởphầnlớntếbàoprokaryote(vikhuân̉)phântửDNAlạicódạngmạchvòng.Tuy nhiên, dù ở dạng nào thì các phân tử DNA này đều tồn tại theo kiểu cuộn chặt. Trong tế bào eukaryote, DNA kết hợp chặt chẽ với các protein là histone.
DNA eukaryote có kích thước rất lớn (Ví dụ: DNA ở người có thể dài đến 1 m) nên vấn đề đặt ra là phân tử này phải được nén như thế nào trong một thể tích rất hạn chế của nhân. Việc nén được thực hiện ở nhiều mức độ, mức độ thấp nhất là nucleosome vàmứcđộcaonhât́làcâútrućnhiêm̃săćchât́.Thâṭvâỵ,đườngkińhcuảchuôĩxoăń
DNAchỉlà20,trongkhisợinhiêm̃săćchât́quansat́dướikińhhiên̉viđiêṇtửcó đường kính 100 , đôi khi đạt 300 . Điều này chứng tỏ phân tử DNA tham gia hình
thành những cấu trúc phức tạp hơn (Hiǹ h 1.3).
Sợi nhiễm sắc chất có đường kính 100 là một chuỗi chứa nhiều nucleosome.
ĐólànhữngcâútrućhiǹhthaǹhtưmôṭsợiDNAquâńquanhmôṭloĩgôm̀8phântử histone (mức độ tổ chức cao nhât́ cuả DNA). Sợi có đường kính 100 này có cấu trúc
phứctap̣ hơnsợicóđườngkińh300 .Trongnhântếbào,cácsợivưakểtrênkếthợp chặt chẽ với nhiều protein khác nhau và cả với các RNA tạo thành nhiễm sắc chất, mức độ tổ chức cao nhất của DNA.
Hình 1.2. Cấu trúc các nucleotide điển hình
Hình 1.3. Cấu trúc nucleosome và nhiễm sắc thể. Phân tử DNA được cuộn lại trên nhiễm sắc thể làm cho chiều dài ngắn lại hơn 50.000 lần.
Các DNA ở eukaryote có đặc điểm khác với DNA prokaryote. Toàn bộ phân tử DNA prokaryote đêù mang thông tin mã hóa cho cać protein trong khi đó DNA của eukaryotebaogôm̀ nhữngtriǹhtựmãhóa(cać exon)xenkẽvớinhữngtriǹhtựkhông mã hóa (intron). Cać triǹ h tự mã hóa ở eukaryote chìm ngập trong một khối lớn DNA mà cho đến nay vẫn chưa rõ tać duṇ g được gọi là “DNA rác” (junk DNA). Tùy theo mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự DNA được chia làm ba loại:
-Cáctrìnhtưlăp̣laịnhiêùlâǹ.Vídu:̣ởđôṇgvâṭcóvúcaćtriǹhtựnaỳchiêḿ 10-15%genome(hệgen).ĐólànhữngtriǹhtựDNAngăń (10-200kb),khôngmãhóa, thườngtậptrungởnhữngvuǹgchuyênbiêṭtrênnhiêm̃săćthểnhưởvuǹgtâmđôṇg (triǹhtựCEN)hayởđâùcaćnhiêm̃săćthể(triǹhtựTEL).Chứcnăngcuảcáctrìnhtự này chưa rõ, có thể chúng tham gia vào quá trình di chuyển DNA trên thoi vô sắc (trình tựCEN)hoặcvàoquátriǹhsaochéptoànbộphầnDNAnăm̀ ởđầumútnhiễmsắcthể (triǹhtựTEL).
- Các trình tư có số lần lặp lại trung biǹ h. Ví dụ: ở genome người các trình tự này chiếm 25-40 %. Chúng đa dạng hơn và có kích thước lớn hơn (100-1.000 kb) các triǹhtựlăp̣laịnhiềulần.Cáctrìnhtựnàyphânbốtrêntoànbộgenome.Chúngcóthểlà
nhữngtriǹhtựkhôngmãhóamàcuñgcóthểlànhữngtriǹhtựmãhóachorRNA,tRNA và 5S RNA.
-Cáctrìnhtưduynhât́.Làcaćgenmãhóachocaćprotein,cótriǹhtựđăc̣trưng cho tưng gen.
Môṭ đặc điểm của phân tử DNA có ý nghĩa rất quan trọng và được sử dụng vào phương pháp lai phân tử, đó là khả năng biến tính và hồi tính. Biến tính là hiện tượng hai sợi đơn cuả phân tử DNA tać h rời nhau khi cać liên kêt́ hydrogen giữa cać base bổ sung nằm trên hai sợi bị đứt do các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm, formamide, urea) haydotácnhânvậtlý(nhiệt).Sauđo,́nêúđiêùchin̉hnhiêṭđộvànôǹgđộmuôíthićh hợp, các sợi đơn có thể băt́ căp̣ trở laị theo nguyên tắc bổ sung, để hình thành phân tử DNA ban đầu, đó là sự hồi tính.
2. Ribonucleic acid
Phân tử RNA có cấu tạo tương tự DNA ngoại trư ba điểm khác biệt sau:
- Phân tử RNA là chuỗi đơn.
- Đường pentose của phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose.
- Thymine (T), môṭ trong bôń loại base hình thành nên phân tử DNA, được thay thế bằng uracil (U) trong phân tử RNA.
Cấu trúc và chức năng của RNA có sự biến đổi rõ rệt. Về cơ bản RNA chỉ là chất mang thông tin di truyền ở virus, sau đó người ta chứng minh rằng nó không những đóng vai trò cơ bản ở việc chuyển thông tin di truyền mà còn có vai trò cấu trúc khi tạo nên phức hệ RNA-protein.
Theomôṭ lýthuyêt́ tiêń hóamàđạidiệnlàEigen,RNAlàchấtmangthôngtindi truyền, thành viên trung gian của sự biểu hiện gen, thành phần cấu tạo và là chất xúc tác. Nhóm OH ở vị trí thứ hai của ribose cần thiết cho đa chức năng làm nhiễu loạn sự tạo thành sợi đôi, qua đó làm tăng độ không bền vững của liên kết phosphodieste.
Trong tế bào có ba loại RNA chính, có các chức năng khác nhau: 2.1. Các RNA thông tin (mRNA)
mRNA là bản sao của những trình tự nhất định trên phân tử DNA, có vai trò trung tâm là chuyển thông tin mã hóa trên phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành phân tử protein tương ứng. Các RNA có cấu trúc đa dạng, kích thước nhỏ hơn so với DNA vì chỉchứathôngtinmãhóachomôṭhoăc̣vaìproteinvàchỉchiêḿkhoan̉g2-5%tôn̉gsố RNA trong tế bào.
Quá trình chuyển thông tin được thể hiện như sau:
Hình 9.10. Các vector họ pUR. Đây là các vector dung hợp với gen lacZ, có các vị trí tạo dòng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII và ClaI ở đầu 3’ của gen lacZ. Sự chèn vào của đoạn DNA ngoại lai (cDNA) trong các vị trí tạo dòng thích hợp cho phép sản xuất protein dung hợp của β-galactosidase hoạt động với chuỗi peptide được mã hóa bởi DNA ngoại lai.
3. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng
Nói chung, có ba cách thường được dùng để xác định mức độ biểu hiện protein
ngoại lai của gen được tạo dòng:
- Điện di polyacrylamide gel có SDS để xác định protein có kích thước thích hợp được sản xuất ở mức độ cao trong các tế bào mang vector biểu hiện. Thông thường, protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue hay bằng AgNO3. Nếu không thấy có băng protein mới khi dùng các thuốc nhuộm này, thì đánh dấu sự trao đổi chất với 100 μCi của [35S]Met hay [35S]Cys trên 1 mL
dịch nuôi cấy trong 5 phút. Sau đó, sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE hay phóng xạ tự ghi có thể phát hiện được protein quan tâm.
- Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện điện di SDS-polyacrylamide gel.
- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện. Như vậy, nếu sự phiên mã hay dịch mã hạn chế biểu hiện thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.
▪ Phân tích Western blot
- Kỹ thuật SDS-PAGE
Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS cho phép phân tách các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường tư cực âm sang cực dương. Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.
- Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể
Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, có thể áp dụng phản ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein. Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào động vật thí nghiệm (thỏ, chuột...) và được tinh sạch tư máu động vật sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương tác với một kháng nguyên nhất định.
Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hay bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích/chuyển thấm lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hay immunoblot) (Hình 9.11). Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase...) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.
Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western
blot. Ngoài ra, kháng thể được sử dụng để tinh sạch protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hay sắc ký ái lực (affinity chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA (Hình 9.11).
V. Phương pháp phát hiện dòng vi khuẩn có DNA tái tổ hợp 1. Lai khuẩn lạc và vết tan
DNA được tạo dòng trong plasmid hay YAC sản xuất ra các khuẩn lạc khi các nuôi cấy biến nạp được dàn mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi cấy dưới những điều kiện thích hợp. Các bacteriophage sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vi khuẩn (bacterial lawn) của lớp agar đỉnh (trong trường hợp này người ta chuẩn bị đĩa agar có hai lớp: lớp agar đỉnh có nồng độ agar thấp để bacteriophage dễ sinh tan tế bào vi khuẩn, và lớp agar đáy có nồng độ agar cao hơn).
Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp). Các chỉ thị này thường là gen kháng kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng.
Hình 9.11. Kỹ thuật Western blot và ELISA dưa trên phản ưng liên kết kháng nguyên- kháng thể
Ngoài ra, các vector còn chứa các gen chỉ thị bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng. Ví dụ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase.
Một dòng (clone) chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc hay vết tan. Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp hay vết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hay nylon bằng cách phủ (overlay) màng này lên trên đĩa agar. DNA được biến tính và cố định trên màng bằng đun nóng (baking) hay chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đã đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Ví dụ: Có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc tư genomic DNA tưng phần, cDNA hay trình tự protein hay sản phẩm PCR. Trong một vài trường hợp, probe có thể được thiết kế dựa trên trình tự bắt nguồn tư gen tương đồng của các loài khác và thường được lai với cường lực thấp. Các probe thưa được rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang. Theo hướng của phim (sau khi rửa) so sánh với đĩa agar gốc, sau đó sẽ
có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang.
2. Sàng lọc thư viện gen bằng PCR
PCR (polymerase chain reaction) cũng có thể được ứng dụng để sàng lọc các thư viện genomic DNA hay cDNA được xây dựng trong các plasmid vector hay bacteriophage vector. Ưu điểm chính của sàng lọc bằng PCR so với sàng lọc dựa trên lai truyền thống là ít tốn thời gian hơn. Sàng lọc bằng PCR có thể được đảm bảo trong 3-4 giờ trong khi đó nó có thể mất một vài ngày trước khi phát hiện bằng kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization). Kỹ thuật sàng lọc bằng PCR thể hiện chỉ thị về kích thước của các đoạn chèn DNA được tạo dòng hơn là trình tự của đoạn chèn, tuy nhiên các primer PCR đặc trưng cho đoạn chèn DNA ngoại lai cũng có thể được sử dụng. Điều này cho phép khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng tư thư viện cDNA và genomic DNA.
▪ Nguyên tắc của PCR
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot.
Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theohàmmũlênđêń haǹgtriêụ lâǹ cać đoaṇ DNAcóchiêù daìkhoảngtư200-3.000bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hay chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ,sốlượngđoạnDNAnóitrênđượcnhânlêngấpnhiêù lâǹ,nhờvậycóthểđủsố lượng để tách ra, phân tích trình tự hay tạo dòng... Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phaỉ tać động trên sợi DNA 5’-3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).
Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.12. Theo đó, tư chu kỳ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hay dài hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di.
PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó tư 10-6 μg DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 μg (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).
- Gắn primer (annealing) ở 40-65oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vịtrícótrìnhtựtươngđồngởDNAkhuônmẫu.Cácliênkếtiontaọ thaǹhmộtđoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu tư các vị trí có primer theo chiều 5’→3’.
Hình 9.12. Sơ đồ phản ưng chuỗi DNA polymerase (PCR) 3. Sàng lọc các thư viện cDNA bằng các probe khác nhau
Sàngloc̣thưviêṇcDNAbằngcáchlainucleicacidlàphươngphaṕđượcsửduṇg phổ biến và đáng tin cậy nhất để tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháplainucleicacidchophépphântíchđồngthờinhiêùdoǹgvànhanh,khôngđoìhoỉ các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hay kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác nhau có thể điều chỉnh các probe của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.
- Các probe tương đồng. Các probe tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA quan tâm. Chúng được dùng trong nhiều trường hợpkhácnhau,vídu:̣khimôṭdoǹgbộphâṇcuảcDNAhiêṇcóđượcsửduṇgđểphân lập một dòng hoàn chỉnh tư thư viện cDNA. Thông thường, đoạn bắt nguồn tư một đầu hay đầu kia của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thămdòthưviện.Laivớicać probetươngđôǹgthườngđượctiêń haǹhdướicać điêù kiện nghiêm ngặt.
-Caćprobetươngđôǹgtừngphâǹ.Cácprobetươngđôǹgtưngphâǹđược dùng để phát hiện các dòng cDNA có quan hệ họ hàng, nhưng không giống hệt nhau hoàn toàn, với các trình tự của probe.
-Cać probeoligonucleotidenhântaọ.Cácprobeoligonucleotidenhântạolàcác vùngdNTPcuảtriǹhtựxaćđiṇhđượctôn̉ghợpinvitro.Triǹhtựcuảcaćprobenaỳ được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, tư các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến của mã di truyền3, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được đoán cho triǹhtự.Măc̣du,̀trongrât́nhiêùtrườnghợp,triǹhtựcaćaminoacidgiôńgnhaucóthể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.
4. Phân tić h genomic DNA bằng phương pháp lai Southern
Việc phát hiện và xác định các chuỗi nucleic acid đặc trưng là công việc thường xuyên trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa vào sự lai phân tử, dưới các điều kiện thích hợp hai chuỗi nucleic acid đơn tạo thành một phân tử lai.Phảnứnglaiphụthuôc̣rât́nhiêùvaòmứcđộtươngđôǹgcuảhaichuôĩnucleotide. Việc tạo thành phân tử sợi đôi như thế xảy ra chủ yếu thông qua liên kết hydrogen giữa các base guanosine với cytosine, và adenosine với thymidine. Thành phần và sự phân bố củacácbasekhônggiôńgrõrêṭvớicaćphântửnucleicacidchokêt́quảcaćtińhchât́lai khác nhau, vì thế liên kết hydrogen (hay lai phân tử giữa các base tương đồng) khi đượcghépcặpthićhhợpđãcungcâṕmôṭcôngcụcógiátrịđểxaćđiṇhcaćchuôĩliên quan hay đồng nhất với chuỗi nucleic acid quan tâm (probe).
Trong số các kỹ thuật khác nhau sử dụng lai phân tử để phân tích nucleic acid, thì kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là lai mâũ dò nucleic acid được đánh dấu với nucleic acid đích được cố định trên một vật đơ rắn, đặc trưng là màng nitrocellulose hay nylon.
TriǹhtựcuảkỹthuậtlaiSouthernblotbaogồmcácbướcsau
hântáchcácđoạn cắt hạn chế của DNA hệ gen bằng điện di agarose gel, chuyển DNA tư agarose gel lên màng lai, lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng lai (Hình 9.13).Hình 9.13. Sơ đồ của kỹ thuật lai Southern blot. Các mẫu DNA đích và genomic DNA (A) và (B) trong ví dụ này được cắt bằng EcoRI và được phân đoạn bằng điện di trên agarose gel. DNA của plasmid mang đoạn chèn DNA dùng làm mẫu dò (C) cũng được cắt bằng EcoRI và điện di như là một đối chứng dương tính.
Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu probe bằng 32P (mặc dù các đồng vị phóng xạ khác như 35S cũng có thể được sử dụng). Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của probe tối thiểu phải là 109 dpm/μg, mặc dù hoạt tính 108 dpm/μg có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không lớn. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.
VI. Các ưng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong đời sống. Các ứng dụng này bao gồm sản xuất dược phẩm và các loại hóa chất khác, các vi khuẩn đặc biệt, các cây trồng nông nghiệp quan trọng, và các vật nuôi đã được biến đổi di truyền... Kỹ thuật này cũng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm y khoa và (trong một vài trường hợp) đang được dùng để kiểm tra các khiếm khuyết di truyền ở người. Hàng trăm công ty hiện nay đang đặc biệt phát triển các sản phẩm thông qua biến đổi di truyền các cơ thể sống. Dưới đây là các ứng dụng chính của công nghệ DNA tái tổ hợp.
1. Ứng dụng trong dược phẩm
Sản phẩm thương mại đầu tiên được phát triển bằng công nghệ DNA tái tổ hợp là các dược phẩm dùng trong điều trị các bệnh và các rối loạn ở người. Năm 1979, Tổ hợp Eli Lilly bắt đầu sản xuất thương mại insulin người bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trước thời điểm này, tất cả insulin dùng trong điều trị bệnh tiểu đường được tách chiết tư tụy của các vật nuôi cho thịt. Mặc dù nguồn insulin này có tác dụng tốt cho nhiều người mắc bệnh tiểu đường, nhưng nó vẫn không phải là insulin người, và một số người đã trải qua các phản ứng phụ với protein ngoại lai. Gen insulin người sau đó đã được chèn vào plasmid và chuyển vào vi khuẩn để sản xuất insulin người. Các dược phẩm được sản xuất thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm: hormone sinh trưởng người (cho trẻ em mắc bệnh còi), nhân tố tạo tơ huyết (chữa bệnh khó đông máu), hoạt tố plasminogen mô (dùng để hòa tan các huyết khối trong bệnh nhân bị nhồi máu cơ tim), interferon, interleukin, DNA vaccine...
2. Các vi khuẩn đặc biệt
Các vi khuẩn có vai trò quan trọng trong các quá trình công nghiệp, bao gồm sản xuất ethanol tư các nguyên liệu thực vật, lọc khoáng tư quặng, xử lý nước thải và các loại chất thải khác. Các vi khuẩn đang sử dụng trong các quá trình này được biến đổi di truyền bằng công nghệ DNA tái tổ hợp sao cho chúng có thể hoạt động hiệu quả hơn. Các chủng vi khuẩn mới hữu ích thu được tư kỹ thuật hiện đại này đang được phát triển để phân hủy các hóa chất độc và các chất gây ô nhiễm, tăng cường thu hồi dầu, tăng nitrogen cho cây trồng, và ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn và vi nấm gây bệnh.
3. Các sản phẩm nông nghiệp
Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng đã có một ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất nông nghiệp, nơi mà hiện nay nó được dùng để tạo ra các cây trồng và vật nuôi mang các đặc điểm có giá trị. Trong nhiều năm, các nhà bệnh học thực vật đã thưa nhận rằng thực vật bị nhiễm bệnh virus thể nhẹ sau đó sẽ kháng lại sự nhiễm trùng các chủng mang độc tính mạnh. Vì vậy, các nhà di truyền học đã tạo ra tính kháng virus trong cây trồng bằng cách chuyển các gen vỏ protein của virus vào tế bào thực vật. Cây bí (squash) biến đổi di truyền có tên là Freedom II, mang các gen của virus 2 gây bệnh khảm ở dưa hấu (watermelon mosaic virus 2) và virus gây bệnh khảm màu vàng ở cây zucchini (zucchini yellow mosaic virus) để chống sự nhiễm trùng virus.
Một hướng khác được biến đổi di truyền đó là tính kháng sâu (pest) ở thực vật đã làm giảm sự phụ thuộc vào các thuốc trư sâu hóa học. Độc tố protein tư vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã giết một cách chọn lọc các ấu trùng của các sâu bọ côn trùng nhất định nhưng lại không gây độc cho sự sống của các động vật hoang dã, người và
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator:
