ninhxuannhan
New Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tui đã thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và người.
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống phân loại của Bergey).
- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng 1,5m x 0,5m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996). E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác.
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 – 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hay eosin methylene blue agar (EMB). Trên môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường.
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - - (biotype 1) hay - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay (2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H.
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
( STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hay VTEC (Vero toxingenic E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
( EPEC (Enteropathogenic E. coli)
( EAEC (Enteroaggregative E. coli)
( ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
( Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hay Vero cytotoxin producing E. coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calder...
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tui đã thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và người.
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống phân loại của Bergey).
- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng 1,5m x 0,5m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996). E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác.
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 – 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hay eosin methylene blue agar (EMB). Trên môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường.
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - - (biotype 1) hay - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay (2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H.
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
( STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hay VTEC (Vero toxingenic E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
( EPEC (Enteropathogenic E. coli)
( EAEC (Enteroaggregative E. coli)
( ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
( Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hay Vero cytotoxin producing E. coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calder...
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: