Download Đề tài Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex pcr trên ba giống bò
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Xác định giới tính phôi động vật có thể mang lại hiệu quả trong chăn nuôi, nhất là đối với động vật cao sản như bò sữa. Nhờ xác định giới tính, ta có thể quyết định nuôi động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn nuôi, và góp phần phục hồi một số loài động vật quí hiếm nhưng gặp khó khăn trong vấn đề sinh sản và đang có nguy cơ tiệt chủng. Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tìm cách xác định giới tính.
Cho đến ngày nay, rất nhiều phương pháp xác định giới tính đã được thực hiện. Những phương pháp bao gồm lai tại chỗ và phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể (NST) Y, phân tích NST hay xác định kháng nguyên H - Y có trên bề mặt các tế bào phôi đực đã được tiến hành rất nhiều. Tuy vậy, các phương pháp này hay có độ tin cậy không cao hay bị hạn chế về lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA quá lớn mà phôi khó cung cấp được). Ngoài các phương pháp trên, người ta còn phát hiện ra phương pháp PCR (polymerase chain reaction). Đây là phương pháp xác định giới tính bằng cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực hiện diện trên NST Y. Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ.
Ở Việt Nam, tiềm năng phát triển chăn nuôi động vật rất lớn, nhất là gia súc, gia cầm. Để phát triển chăn nuôi, định hướng nuôi con gì, giới tính nào, số lượng bao nhiêu là rất quan trọng. Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định sẽ nuôi bao nhiêu thú cung cấp sữa, bao nhiêu thú cung cấp thịt và vẫn giữ đúng định hướng ấy mà lại giảm thiểu đáng kể tổn thất về kinh tế.
Hiện tại, Việt Nam đang cố gắng tạo được đàn bò có số lượng và chất lượng đủ đáp ứng về thịt và sữa cho người tiêu dùng trong nước, một phần có thể xuất khẩu. Khi đó, việc nhập phôi đông lạnh hay tạo hàng loạt phôi được phân biệt giới tính rõ ràng bằng các kỹ thuật chẩn đoán giới tính hiện đại sẽ là hai trong số những giải pháp cho vấn đề này. Vì phôi đông lạnh được phân biệt giới tính trước thì quá đắt, cho nên việc tạo phôi động vật nhân tạo là hướng giải quyết mang tầm chiến lược về kinh tế và khoa học. Mặc khác, việc tạo ra được phôi của động vật cao sản không phải là vấn đề đơn giản ở Việt Nam trong thời điểm hiện tại, nhất là ở những cơ sở nhỏ. Do đó, để thiết lập các qui trình xác định giới tính phôi sẽ gặp khó khăn ở nguồn mẫu. Thế nhưng, nếu không thiết lập qui trình xác định giới tính, đến khi đã tạo được phôi thì sẽ không thể nào phân biệt được giới tính. Lúc đó, phải mất nhiều thời gian để tìm ra qui trình. Chính vì thế, đề tài này sẽ sử dụng các nguồn mẫu như cơ, lông bò để thiết lập qui trình chẩn đoán giới tính. Khi tạo được phôi bò, lúc đó sẽ dùng qui trình này để xác định giới tính phôi tạo ra. Đó chính là ý nghĩa cấp thiết của đề tài.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu
Tìm ra qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính của các giống bò ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan dựa trên sự khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực.
1.2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông của 3 giống bò (ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan).
- Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành công.
- Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng trong qui trình PCR.
- Ứng dụng qui trình PCR tìm được để xác định giới tính ba giống bò ta Vàng, lai Sind, và sữa Hà Lan.
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA
2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò
Hiện tại, ở nước ta có rất nhiều giống bò được nuôi. Tuy nhiên, số lượng của mỗi giống thì rất khác nhau (Nguyễn Trọng Tiến và ctv, 2001). Chủ yếu là những giống sau:
- Bò ta Vàng: có nguồn gốc trong nước; lông có màu vàng, vàng nhạt hay vàng đậm; nhỏ vóc, năng suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg.
- Bò lai Sind: tạo ra từ việc lai giữa bò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời với bò trong nước. Bò có lông màu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng lượng khoảng 200 - 400 kg. Bò cái thường được dùng làm nền để phối với các bò đực tốt từ nước ngoài về.
- Bò sữa Hà Lan: thường là dạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà Lan với bò trong nước (lai Sind). Bò có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung bình 200 - 500 kg, khả năng cho sữa 15 - 20 lít / ngày.
Ở Việt Nam, bò nuôi có tỷ lệ đậu thai thấp (60%). Hơn nữa, bò cái ở Việt Nam có vóc nhỏ nên khó phối với bò đực ngoại vóc lớn. Vì vậy, để có bò cái nền cần làm cho chúng lớn vóc lên. Đây là vấn đề rất lâu dài và khó khăn trong công tác giống.
2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA
2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò
Cơ được sử dụng trong quá trình ly trích DNA là cơ vân. Tế bào cơ vân là dạng tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được từ cơ rất nhiều. Protein trong cơ vân chủ yếu là actin, myosin và myoglobin. Trong đó, myoglobin là loại protein thuộc nhóm chromoprotein giúp tạo màu đỏ trong bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003). Myoglobin được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị globin gắn với 1 nhóm heme. Dù là một loại protein phức tạp nhưng nó dễ bị phân cắt bởi các proteinase vì trong cấu trúc của nó không có liên kết disulfide.
2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò
Ở thú hữu nhũ, lông là một dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ bên ngoài cơ thể. Lông xuất phát từ nang lông, có nguồn gốc từ lớp bì. Xét về cấu trúc cắt ngang, lông gồm có 3 lớp: lớp ngoài gọi là lớp sừng, được cấu tạo từ những tế bào chết; kế đến là lớp vỏ tạo màu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; trong cùng là lớp tuỷ. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lông có chứa rất nhiều tế bào còn sống (Frandson và ctv, 1969).
Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv (2003), keratin là một loại protein cứng thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính không tan trong các dung dịch trung tính, chỉ hoà tan trong các dung dịch acid loãng hay kiềm tính. Theo Lê Thị Mỹ Phước và ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon. Thường có 2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin. α-keratin có cấu trúc vòng với nhiều liên kết cystine. Trong khi đó β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp. Nét đặc biệt của keratin là hàm lượng cystine rất cao nên giữa các mạch polypeptide có nhiều liên kết ngang disulfide. Vì vậy keratin có tính bền vững cao và có cấu trúc cấp hai rất khác nhau. Chính vì lý do đó, chúng khó bị phân cắt bởi các enzyme proteinase không chuyên biệt.
Ngoài keratin, melanin cũng là một loại protein khó bị loại khỏi DNA cần tách chiết. Melanin có 3 loại chính là eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố nâu đỏ) và allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002). Màu sắc của lông tùy thuộc vào loại melanin có trong lớp vỏ của lông. Đôi khi lớp vỏ bị mất hết melanin làm cho lông có màu trắng. Sự hiểu biết về melanin cho đến nay không nhiều lắm. Người ta thường đề cập đến melanin ở dạng polymer sinh học tự nhiên. Nhiều đặc tính hoá học của melanin chưa được biết rõ nên rất khó cho việc tìm cách tách melanin ra khỏi dung dịch chứa DNA mẫu.
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
- DNA ly trích từ cơ tinh sạch và đạt năng suất cao hơn DNA ly trích từ lông.
- DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn DNA ly trích từ ngọn lông.
- Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian của phản ứng) và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính thành công trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%.
- Mức độ làm khô DNA trong giai đoạn thu hồi DNA ảnh hưởng đến hiệu quả PCR xác định giới tính.
- Sử dụng DNA ly trích từ lông trong PCR xác định giới tính cho hiệu quả thấp hơn so với sử dụng DNA ly trích từ cơ.
5.2 ĐỀ NGHỊ
- Thiết lập qui trình ly trích DNA từ lông (nhất là ngọn lông) để được lượng DNA lớn và tinh sạch.
- Theo dõi về thời gian và biểu hiện khô của DNA trong quá trình thu hồi DNA sau ly trích.
- Áp dụng qui trình PCR xác định giới tính lên phôi bò của ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
* Tài liệu tiếng Việt
1. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro và dùng pcr xác định giới tính phôi trên heo. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 122 – tr. 129 và tr. 190 - tr. 197.
3. Phạm Thành Hổ, 2000. Sinh Học Đại Cương. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 274.
4. Nguyễn Thị Thu Lan, 2002. Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) bằng kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
5. Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000. Sinh Học Của Sự Sinh Sản. Tái bản lần thứ nhất, NXB Giáo Dục. Tr. 50 – tr. 64.
6. Nguyễn Phước Nhuận, Phan Thế Đồng, Lê Thị Phương Hồng, Đỗ Hiếu Liêm, Đinh Ngọc Loan, 2003. Giáo Trình Sinh Hóa Học (Phần I). NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 68 – tr. 73.
7. Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Văn Bình, Bùi Thị Hồng Hạnh, 2002. Hóa Học Phục Vụ Công Nghệ Sinh Học II. Giáo trình thực tập Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 36.
8. Lê Thị Thu Phương, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
9. Nguyễn Trọng Tiến, Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban, 2001. Giáo Trình Chăn Nuôi Trâu Bò. NXB Nông Nghiệp. Tr. 23 – tr. 30.
*Tài liệu nước ngoài
10. AIP Congress, 2002. Semiconducting photoactive biopolymers. AIP Congress, Queensland University, Australia. 20 pages.
11. Alves A. C. B., Hossepian de Lima M. F. V., Teixera M. C., Moreira-Filho A. C., 2003. Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos. Theriogenology 59: 1415-1419.
12. Bondioli K. R., et al., 1989. The use of male – specific chromosomal DNA fragments to determine the sex of bovine preimplantation embryos. Theriogenology 31: 95-104.
13. Bredbacka P., et al., 1994. Survival of biopsied and sexed bovine demi embryos. Theriogenology 41: 1023-1031.
14. Burgoyne, 1998. The mammalian Y chromosome: a new perspective. BioEssay 20: 363-366.
15. Chen C. M., Hu C. L., Wang C. H., Hung C. M., Wu H. K., Choo K. B., and Cheng W. T. K., 1999. Gender determination in single bovine blastomere by polymerase chain reaction amplification of sex - specific polymorphic fragments in the Amelogenin gene. Molecular reproduction and development 54: 209-214.
16. Chen C. Y., Huang L. S., Cheng J. B., Ding N. S., Zhou L. L., and Xiao H. X., 2004. Establishing and optimizing the system for sex determination of bovine preimplantation embryos. China Journal of Agricultural Biotechnology 1(1): 13-16.
17. Delbrigde L. M. and Marshall Graves A. J., 1999. Mammalian Y chromosome evolution and the male – specific functions of Y chromosome – borne genes. Journal of Reproduction and Fertility 4: 101-109.
18. Eldridge E. F., 1985. Cytogenetics of livestock. Avi publishing company, Wesport, Connecticut, USA. p.115 – p. 122.
19. Frandson D. R., 1969. Anatomy and physiology of farm animals. Lea and Febiger, Philadelphia, USA. Chapter 28, p. 386 – p. 389.
20. Haqq M. C. and Donahoe K. P., 1998. Regulation of sex dimorphism in Mammals. Physiol. Rev. 78: 1-33.
21. Josso N., Rey R. and Gonzalès J., 2003. Sexual differentiation. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2005.
You must be registered for see links
>PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Xác định giới tính phôi động vật có thể mang lại hiệu quả trong chăn nuôi, nhất là đối với động vật cao sản như bò sữa. Nhờ xác định giới tính, ta có thể quyết định nuôi động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn nuôi, và góp phần phục hồi một số loài động vật quí hiếm nhưng gặp khó khăn trong vấn đề sinh sản và đang có nguy cơ tiệt chủng. Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tìm cách xác định giới tính.
Cho đến ngày nay, rất nhiều phương pháp xác định giới tính đã được thực hiện. Những phương pháp bao gồm lai tại chỗ và phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể (NST) Y, phân tích NST hay xác định kháng nguyên H - Y có trên bề mặt các tế bào phôi đực đã được tiến hành rất nhiều. Tuy vậy, các phương pháp này hay có độ tin cậy không cao hay bị hạn chế về lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA quá lớn mà phôi khó cung cấp được). Ngoài các phương pháp trên, người ta còn phát hiện ra phương pháp PCR (polymerase chain reaction). Đây là phương pháp xác định giới tính bằng cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực hiện diện trên NST Y. Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ.
Ở Việt Nam, tiềm năng phát triển chăn nuôi động vật rất lớn, nhất là gia súc, gia cầm. Để phát triển chăn nuôi, định hướng nuôi con gì, giới tính nào, số lượng bao nhiêu là rất quan trọng. Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định sẽ nuôi bao nhiêu thú cung cấp sữa, bao nhiêu thú cung cấp thịt và vẫn giữ đúng định hướng ấy mà lại giảm thiểu đáng kể tổn thất về kinh tế.
Hiện tại, Việt Nam đang cố gắng tạo được đàn bò có số lượng và chất lượng đủ đáp ứng về thịt và sữa cho người tiêu dùng trong nước, một phần có thể xuất khẩu. Khi đó, việc nhập phôi đông lạnh hay tạo hàng loạt phôi được phân biệt giới tính rõ ràng bằng các kỹ thuật chẩn đoán giới tính hiện đại sẽ là hai trong số những giải pháp cho vấn đề này. Vì phôi đông lạnh được phân biệt giới tính trước thì quá đắt, cho nên việc tạo phôi động vật nhân tạo là hướng giải quyết mang tầm chiến lược về kinh tế và khoa học. Mặc khác, việc tạo ra được phôi của động vật cao sản không phải là vấn đề đơn giản ở Việt Nam trong thời điểm hiện tại, nhất là ở những cơ sở nhỏ. Do đó, để thiết lập các qui trình xác định giới tính phôi sẽ gặp khó khăn ở nguồn mẫu. Thế nhưng, nếu không thiết lập qui trình xác định giới tính, đến khi đã tạo được phôi thì sẽ không thể nào phân biệt được giới tính. Lúc đó, phải mất nhiều thời gian để tìm ra qui trình. Chính vì thế, đề tài này sẽ sử dụng các nguồn mẫu như cơ, lông bò để thiết lập qui trình chẩn đoán giới tính. Khi tạo được phôi bò, lúc đó sẽ dùng qui trình này để xác định giới tính phôi tạo ra. Đó chính là ý nghĩa cấp thiết của đề tài.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu
Tìm ra qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính của các giống bò ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan dựa trên sự khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực.
1.2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông của 3 giống bò (ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan).
- Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành công.
- Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng trong qui trình PCR.
- Ứng dụng qui trình PCR tìm được để xác định giới tính ba giống bò ta Vàng, lai Sind, và sữa Hà Lan.
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA
2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò
Hiện tại, ở nước ta có rất nhiều giống bò được nuôi. Tuy nhiên, số lượng của mỗi giống thì rất khác nhau (Nguyễn Trọng Tiến và ctv, 2001). Chủ yếu là những giống sau:
- Bò ta Vàng: có nguồn gốc trong nước; lông có màu vàng, vàng nhạt hay vàng đậm; nhỏ vóc, năng suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg.
- Bò lai Sind: tạo ra từ việc lai giữa bò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời với bò trong nước. Bò có lông màu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng lượng khoảng 200 - 400 kg. Bò cái thường được dùng làm nền để phối với các bò đực tốt từ nước ngoài về.
- Bò sữa Hà Lan: thường là dạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà Lan với bò trong nước (lai Sind). Bò có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung bình 200 - 500 kg, khả năng cho sữa 15 - 20 lít / ngày.
Ở Việt Nam, bò nuôi có tỷ lệ đậu thai thấp (60%). Hơn nữa, bò cái ở Việt Nam có vóc nhỏ nên khó phối với bò đực ngoại vóc lớn. Vì vậy, để có bò cái nền cần làm cho chúng lớn vóc lên. Đây là vấn đề rất lâu dài và khó khăn trong công tác giống.
2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA
2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò
Cơ được sử dụng trong quá trình ly trích DNA là cơ vân. Tế bào cơ vân là dạng tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được từ cơ rất nhiều. Protein trong cơ vân chủ yếu là actin, myosin và myoglobin. Trong đó, myoglobin là loại protein thuộc nhóm chromoprotein giúp tạo màu đỏ trong bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003). Myoglobin được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị globin gắn với 1 nhóm heme. Dù là một loại protein phức tạp nhưng nó dễ bị phân cắt bởi các proteinase vì trong cấu trúc của nó không có liên kết disulfide.
2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò
Ở thú hữu nhũ, lông là một dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ bên ngoài cơ thể. Lông xuất phát từ nang lông, có nguồn gốc từ lớp bì. Xét về cấu trúc cắt ngang, lông gồm có 3 lớp: lớp ngoài gọi là lớp sừng, được cấu tạo từ những tế bào chết; kế đến là lớp vỏ tạo màu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; trong cùng là lớp tuỷ. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lông có chứa rất nhiều tế bào còn sống (Frandson và ctv, 1969).
Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv (2003), keratin là một loại protein cứng thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính không tan trong các dung dịch trung tính, chỉ hoà tan trong các dung dịch acid loãng hay kiềm tính. Theo Lê Thị Mỹ Phước và ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon. Thường có 2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin. α-keratin có cấu trúc vòng với nhiều liên kết cystine. Trong khi đó β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp. Nét đặc biệt của keratin là hàm lượng cystine rất cao nên giữa các mạch polypeptide có nhiều liên kết ngang disulfide. Vì vậy keratin có tính bền vững cao và có cấu trúc cấp hai rất khác nhau. Chính vì lý do đó, chúng khó bị phân cắt bởi các enzyme proteinase không chuyên biệt.
Ngoài keratin, melanin cũng là một loại protein khó bị loại khỏi DNA cần tách chiết. Melanin có 3 loại chính là eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố nâu đỏ) và allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002). Màu sắc của lông tùy thuộc vào loại melanin có trong lớp vỏ của lông. Đôi khi lớp vỏ bị mất hết melanin làm cho lông có màu trắng. Sự hiểu biết về melanin cho đến nay không nhiều lắm. Người ta thường đề cập đến melanin ở dạng polymer sinh học tự nhiên. Nhiều đặc tính hoá học của melanin chưa được biết rõ nên rất khó cho việc tìm cách tách melanin ra khỏi dung dịch chứa DNA mẫu.
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
- DNA ly trích từ cơ tinh sạch và đạt năng suất cao hơn DNA ly trích từ lông.
- DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn DNA ly trích từ ngọn lông.
- Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian của phản ứng) và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính thành công trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%.
- Mức độ làm khô DNA trong giai đoạn thu hồi DNA ảnh hưởng đến hiệu quả PCR xác định giới tính.
- Sử dụng DNA ly trích từ lông trong PCR xác định giới tính cho hiệu quả thấp hơn so với sử dụng DNA ly trích từ cơ.
5.2 ĐỀ NGHỊ
- Thiết lập qui trình ly trích DNA từ lông (nhất là ngọn lông) để được lượng DNA lớn và tinh sạch.
- Theo dõi về thời gian và biểu hiện khô của DNA trong quá trình thu hồi DNA sau ly trích.
- Áp dụng qui trình PCR xác định giới tính lên phôi bò của ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
* Tài liệu tiếng Việt
1. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro và dùng pcr xác định giới tính phôi trên heo. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 122 – tr. 129 và tr. 190 - tr. 197.
3. Phạm Thành Hổ, 2000. Sinh Học Đại Cương. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 274.
4. Nguyễn Thị Thu Lan, 2002. Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) bằng kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
5. Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000. Sinh Học Của Sự Sinh Sản. Tái bản lần thứ nhất, NXB Giáo Dục. Tr. 50 – tr. 64.
6. Nguyễn Phước Nhuận, Phan Thế Đồng, Lê Thị Phương Hồng, Đỗ Hiếu Liêm, Đinh Ngọc Loan, 2003. Giáo Trình Sinh Hóa Học (Phần I). NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 68 – tr. 73.
7. Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Văn Bình, Bùi Thị Hồng Hạnh, 2002. Hóa Học Phục Vụ Công Nghệ Sinh Học II. Giáo trình thực tập Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 36.
8. Lê Thị Thu Phương, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
9. Nguyễn Trọng Tiến, Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban, 2001. Giáo Trình Chăn Nuôi Trâu Bò. NXB Nông Nghiệp. Tr. 23 – tr. 30.
*Tài liệu nước ngoài
10. AIP Congress, 2002. Semiconducting photoactive biopolymers. AIP Congress, Queensland University, Australia. 20 pages.
11. Alves A. C. B., Hossepian de Lima M. F. V., Teixera M. C., Moreira-Filho A. C., 2003. Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos. Theriogenology 59: 1415-1419.
12. Bondioli K. R., et al., 1989. The use of male – specific chromosomal DNA fragments to determine the sex of bovine preimplantation embryos. Theriogenology 31: 95-104.
13. Bredbacka P., et al., 1994. Survival of biopsied and sexed bovine demi embryos. Theriogenology 41: 1023-1031.
14. Burgoyne, 1998. The mammalian Y chromosome: a new perspective. BioEssay 20: 363-366.
15. Chen C. M., Hu C. L., Wang C. H., Hung C. M., Wu H. K., Choo K. B., and Cheng W. T. K., 1999. Gender determination in single bovine blastomere by polymerase chain reaction amplification of sex - specific polymorphic fragments in the Amelogenin gene. Molecular reproduction and development 54: 209-214.
16. Chen C. Y., Huang L. S., Cheng J. B., Ding N. S., Zhou L. L., and Xiao H. X., 2004. Establishing and optimizing the system for sex determination of bovine preimplantation embryos. China Journal of Agricultural Biotechnology 1(1): 13-16.
17. Delbrigde L. M. and Marshall Graves A. J., 1999. Mammalian Y chromosome evolution and the male – specific functions of Y chromosome – borne genes. Journal of Reproduction and Fertility 4: 101-109.
18. Eldridge E. F., 1985. Cytogenetics of livestock. Avi publishing company, Wesport, Connecticut, USA. p.115 – p. 122.
19. Frandson D. R., 1969. Anatomy and physiology of farm animals. Lea and Febiger, Philadelphia, USA. Chapter 28, p. 386 – p. 389.
20. Haqq M. C. and Donahoe K. P., 1998. Regulation of sex dimorphism in Mammals. Physiol. Rev. 78: 1-33.
21. Josso N., Rey R. and Gonzalès J., 2003. Sexual differentiation. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2005.
22. Kitiyanant Y., Saikhun J., Siriaroonrat B., and Pavasuthipaisit K., 2000. Sex determination by polymerase chain reaction and karyotyping of bovine embryos at first cleavage in vitro. Science Asia 26: 9-13.
23. Page D. C., Mosher R., Simpson E., Fisher E. M. C., Mardon G., Pollack J., Mc Gillivray B., De la chapelle A., and Brown L. G., 1987. The sex determing region of the human Y chromosome encodes a finger protein. Cell 36: 1091-1104.
24. Pomp D., Good A. B., Geisert D. R., Corbin J. C., and Conley J. A., 1995. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim., Sci. 73: 1408- 1415.
25. Sambrook Joseph and Russell W. David, 2001. Molecular cloning (A laboratory manual). 3rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA. Vol.2: p. 8.23, Vol.3: p. A8.13.
26. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Full flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the GOOD assay. Nucleic Acids Research Vol.28, No.23.
27. Schoder A., Miller R. J., Thomsen D. P., Roschlau K., Avery B., poulsen H. P., Schmitt M., and Swerin M., 1990. Sex determination of bovine embryos using the polymerase chain reaction. Animal Biotechnology 1(2): 121-133.
28. Takara Bio Inc. CycleavePCRTM Bovine Sexing Kit. Ho Chi Minh city, Viet Nam, June 2005.
29. Van Vliet A. R., Gibbins V. M. A., and Walton S. J., 1989. Livestock embryo sexing: a review of current methods, with emphasis on Y- Specific DNA probes. Theriogenology 32(3): 421-438.
PHỤ LỤC
* Hoá chất dùng trong đề tài
- Hoá chất ly trích DNA
+ Đệm ly trích cơ và lông (chỉnh pH đến 8)
Tris - HCl 50 mM
NaCl 20 mM
EDTA (Ethylene diamine tetra - acetic acid) 1 mM
SDS (Sodium dodecyl sulfate) 1 %
+ Proteinase K 20 mg / ml
+ Sodium acetate 2 M; 0,2 M
+ Phenol: chloroform: isoamyl alcohol 25:24:1
+ Ethanol 100%; 70%
+ TE 1X (pH = 8)
Tris - HCl 10 mM
Na2EDTA 1 mM
- Hoá chất PCR
PCR buffer 1 X
MgCl2 1,5 mM
Taq polymerase tùy phản ứng
dNTP 200 μM / mỗi loại
H2O cất 2 lần, khử ion, vô trùng, chiếu tia UV 15 phút, pH 6,8 – 7,0
- Hoá chất điện di sản phẩm PCR
+ Agarose 1,5%
+ TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3)
Tris - base 44,5 mM
Acid boric 44,5 mM
Na2EDTA 1,5 mM
+ Loading dye 6 X
Bromophenol blue 0,25 %
Sucrose 40 %
TE 1 X vừa đủ 100 %
+ Ladder
TAE 0,5 X (Tris acetate EDTA) 65 %
Ladder 100 bp gốc 15 %
Loading dye 6 X 20 %
+ Ethidium bromide 30 μl / 300 ml TBE 0,5 X
* công cụ dùng trong đề tài
- Pipetman loại 100 - 1000 μl; 10 - 100 μl; 0,5 - 10 μl
- Đầu tip tương ứng với các loại pipetman
- Eppendorf loại 0,2 ml; 1,5 ml
- Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu
- Kéo, kẹp, chày, cối, bao nilông…
* Thiết bị được sử dụng trong đề tài
- Máy vortex (IKA Works)
- Máy ly tâm (Sigma, Hettich)
- Máy PCR (Eppendorf)
- Bộ điện di (Biorad)
- Máy chụp gel (Biorad)
- Tủ ấm (Memmert)
- Tủ trữ mẫu, hoá chất (Reetech, Brandt, Sanyo)
- Microwave (Electrolux)
- Cân (explorer- OHAUS)
- Tủ sấy (Jencons - PLS)
- Water bath (Memmert)
- Máy cất nước, khử ion (Barnstead)
- Autoclave (Tommy)
- Quang phổ kế (Hewlett Packard)
- Máy đo pH
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: