Thieugia_duy
New Member
Download Luận văn Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh
Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch[5] [32]
a. Nguyên tắc
Thuốc thửphản ứng với cơchất tạo màu đặc trưng, còn phần cơchất bịnấm sợi phân huỷsẽ
không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL.
b. Thực hiện
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bịcác chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử
hoạt tính tương ứng (MT2).
Giữcác hộp petri này trong tủ ấm 28 độ C – 30 độ C, trong 4-5 ngày.
c. Kiểm tra kết quả
Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thửtương ứng:
+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổdung dịch thuốc thử10% HgCl2lên bềmặt MT nuôi cấy, nếu
nấm sợi sinh ra proteaza sẽcó một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tửprotein
bịphân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tửprotein chưa bịphân giải có màu
trắng đục.
+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cảhai loại enzym này đều dùng thuốc thửlugol nhỏ
lên bềmặt thạch:
* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽtạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị
phân giải có màu tím hồng nhạt.
* Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽtạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng tinh bột chưa bị
phân giải có màu xanh tím đậm.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2.
Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hay giấy thấm) nước vô trùng.
Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại
và cho vào hộp petri có sẵn bông (hay giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp
petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C.
Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên
phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát
hình thái nấm sợi. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm:
+ Giá BTT, thể bình và cuống thể bình.
+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.
+ Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai.
Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.[5] [6]
2.2.1.5 Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch [5] [32]
a. Nguyên tắc
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân huỷ sẽ
không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL.
b. Thực hiện
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử
hoạt tính tương ứng (MT2).
Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 280C – 300C, trong 4-5 ngày.
c. Kiểm tra kết quả
Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:
+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10% HgCl2 lên bề mặt MT nuôi cấy, nếu
nấm sợi sinh ra proteaza sẽ có một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tử protein
bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu
trắng đục.
+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cả hai loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ
lên bề mặt thạch:
* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị
phân giải có màu tím hồng nhạt.
* Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng tinh bột chưa bị
phân giải có màu xanh tím đậm.
d. Đánh giá khả năng tạo enzym
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d).
(D-d) 25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20mm : hoạt tính mạnh
(D-d) 10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu
2.2.1.6 Kiểm tra khả năng ĐK của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch.
[5]
a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất ĐK thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt
các VSVKĐ và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b. Tiến hành thí nghiệm
* Phương pháp khối thạch
Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp (MT4), không dùng nước biển mà
dùng nước cất thay thế.
Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng nấm sợi cần thử hoạt tính ĐK. Đặt
các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định.
c. Kiểm tra kết quả
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d).
(D-d) 25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20mm : hoạt tính mạnh
(D-d) 10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu
2.2.1.7 Kiểm tra khả năng chịu mặn của nấm sợi [6]
a. Nguyên tắc
Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể
hiện các hoạt tính khác nhau.
b. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%.
Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối
khác nhau.
Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl.
c. Kết quả
Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của
độ mặn lên khả năng sinh trưởng.
Thử hoạt tính enzim ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 và hoạt tính ĐK theo phương pháp
2.2.1.6 ứng với từng nồng độ muối.
2.2 Phương pháp toán học
Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản
- Phương pháp tính giá trị trung bình
: Giá trị trung bình n lần thí nghiệm.
Xi : Giá trị lần thí nghiệm thứ i
n : Số lần lặp lại thí nghiệm
- Phương pháp tính khoảng ước lượng
Trong đó:
tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía.
Sn+2(X) là phương sai mẫu.
Sn+2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2
a = ± tα S + 2n (X)
√n
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Quá trình lấy mẫu được tiến hành ở 4 xã: Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn
Hiệp thuộc Huyện Cần Giờ. Các vị trí lấy mẫu được thể hiện trên bản đồ hình 3.1
Hình 3.1: Bản đồ xác định các vị trí lấy mẫu đợt 1
- Chúng tui dùng máy GPF định vị vệ tinh toàn cầu để xác định toạ độ của 4 xã như sau:
* Tam Thôn Hiệp: 10035’17.14’’N
106049’26.54’’E
* An Thới Đông: 10034’34.65’’N
106049’20.53’’E
* Lý Nhơn 10033’34.45’’N
106049’18.13’’E
* Long Hoà 10029’37.11’’N
106052’07.45’’E
Qua 3 đợt lấy mẫu chúng tui phân lập được 476 chủng nấm sợi. Trong đó, đợt 1 phân lập được
129 chủng (chiếm 27,10%) , đợt 2 được 191 chủng (40,13%), đợt 3 được 156 chủng (32,77%).
Sau đó, chúng tui tiếp tục phân loại để tuyển chọn các chủng nấm sợi thuộc hai chi Aspergillus
và Penicillium. Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S.
Heekstra, Jens C. Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2000). Chúng tui xếp các chủng vi nấm có
đặc điểm như trong bảng 3.1 vào hai chi Aspergillus và Penicillium.
Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại tương ứng để xác định các chủng vi nấm
đến chi Aspergillus và chi Penicillium [6]
Một số đặc điểm chi Aspergillus Một số đặc điểm chi Penicillium
- Khuẩn lạc màu lục xám, xanh
xám, xám, luc, lục vàng, lục nâu,
nâu đen, trắng, vàng.
- Sợi nấm có vách ngăn, phân
nhánh, không màu hay màu nhạt.
- Bộ máy mang BTT không
nhánh
- Giá BTT phát triển từ tế bào
chân, không có hay có ít vách
ngăn.
- Bọng hình chuỳ, hình elíp, hình
nữa cầu hay hình cầu.
- Thể bình một tầng hay hai
tầng.
- BTT không có vách ngăn, mặt
ngoài nhẵn hay có gai, hoăc có
nốt sần.
- Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám
đôi khi có màu vàng, đỏ tím hay trắng.
- Mặt trái KL không màu hay có màu sắc khác
nhau.
- KL có hay không có vết khía xuyên tâm hay
đồng tâm, có hay không có các giọt tiết.
- KL có mặt dạng nhung hay mặt dạng len hay
xốp bông.
- Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu
hay màu nhạt, đôi khi màu sẫm.
- Bộ máy mang BTT hay không nhánh hay có
nhánh.
- Giá BTT với một vòng thể bình hay với hai đến
nhiều cuống thể bình ở phần ngọn giá.
- Thể bình có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần.
- BTT không có vách, hình cầu, gần cầu, hình
trứng, elíp đôi khi hình trụ, không màu hay màu
nhạt; mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai h...
Download miễn phí Luận văn Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh
Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch[5] [32]
a. Nguyên tắc
Thuốc thửphản ứng với cơchất tạo màu đặc trưng, còn phần cơchất bịnấm sợi phân huỷsẽ
không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL.
b. Thực hiện
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bịcác chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử
hoạt tính tương ứng (MT2).
Giữcác hộp petri này trong tủ ấm 28 độ C – 30 độ C, trong 4-5 ngày.
c. Kiểm tra kết quả
Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thửtương ứng:
+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổdung dịch thuốc thử10% HgCl2lên bềmặt MT nuôi cấy, nếu
nấm sợi sinh ra proteaza sẽcó một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tửprotein
bịphân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tửprotein chưa bịphân giải có màu
trắng đục.
+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cảhai loại enzym này đều dùng thuốc thửlugol nhỏ
lên bềmặt thạch:
* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽtạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị
phân giải có màu tím hồng nhạt.
* Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽtạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng tinh bột chưa bị
phân giải có màu xanh tím đậm.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ợp (MEA, YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri.Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2.
Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hay giấy thấm) nước vô trùng.
Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại
và cho vào hộp petri có sẵn bông (hay giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp
petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C.
Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên
phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát
hình thái nấm sợi. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm:
+ Giá BTT, thể bình và cuống thể bình.
+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.
+ Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai.
Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.[5] [6]
2.2.1.5 Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch [5] [32]
a. Nguyên tắc
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân huỷ sẽ
không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL.
b. Thực hiện
* Phương pháp cấy chấm điểm
Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp.
Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử
hoạt tính tương ứng (MT2).
Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 280C – 300C, trong 4-5 ngày.
c. Kiểm tra kết quả
Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng:
+ Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10% HgCl2 lên bề mặt MT nuôi cấy, nếu
nấm sợi sinh ra proteaza sẽ có một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tử protein
bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu
trắng đục.
+ Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cả hai loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ
lên bề mặt thạch:
* Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị
phân giải có màu tím hồng nhạt.
* Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng tinh bột chưa bị
phân giải có màu xanh tím đậm.
d. Đánh giá khả năng tạo enzym
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d).
(D-d) 25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20mm : hoạt tính mạnh
(D-d) 10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu
2.2.1.6 Kiểm tra khả năng ĐK của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch.
[5]
a. Nguyên tắc
Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất ĐK thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt
các VSVKĐ và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
b. Tiến hành thí nghiệm
* Phương pháp khối thạch
Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp (MT4), không dùng nước biển mà
dùng nước cất thay thế.
Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng nấm sợi cần thử hoạt tính ĐK. Đặt
các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định.
c. Kiểm tra kết quả
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d).
(D-d) 25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d) 20mm : hoạt tính mạnh
(D-d) 10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu
2.2.1.7 Kiểm tra khả năng chịu mặn của nấm sợi [6]
a. Nguyên tắc
Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể
hiện các hoạt tính khác nhau.
b. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%.
Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối
khác nhau.
Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl.
c. Kết quả
Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của
độ mặn lên khả năng sinh trưởng.
Thử hoạt tính enzim ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 và hoạt tính ĐK theo phương pháp
2.2.1.6 ứng với từng nồng độ muối.
2.2 Phương pháp toán học
Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản
- Phương pháp tính giá trị trung bình
: Giá trị trung bình n lần thí nghiệm.
Xi : Giá trị lần thí nghiệm thứ i
n : Số lần lặp lại thí nghiệm
- Phương pháp tính khoảng ước lượng
Trong đó:
tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía.
Sn+2(X) là phương sai mẫu.
Sn+2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2
a = ± tα S + 2n (X)
√n
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Quá trình lấy mẫu được tiến hành ở 4 xã: Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn
Hiệp thuộc Huyện Cần Giờ. Các vị trí lấy mẫu được thể hiện trên bản đồ hình 3.1
Hình 3.1: Bản đồ xác định các vị trí lấy mẫu đợt 1
- Chúng tui dùng máy GPF định vị vệ tinh toàn cầu để xác định toạ độ của 4 xã như sau:
* Tam Thôn Hiệp: 10035’17.14’’N
106049’26.54’’E
* An Thới Đông: 10034’34.65’’N
106049’20.53’’E
* Lý Nhơn 10033’34.45’’N
106049’18.13’’E
* Long Hoà 10029’37.11’’N
106052’07.45’’E
Qua 3 đợt lấy mẫu chúng tui phân lập được 476 chủng nấm sợi. Trong đó, đợt 1 phân lập được
129 chủng (chiếm 27,10%) , đợt 2 được 191 chủng (40,13%), đợt 3 được 156 chủng (32,77%).
Sau đó, chúng tui tiếp tục phân loại để tuyển chọn các chủng nấm sợi thuộc hai chi Aspergillus
và Penicillium. Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S.
Heekstra, Jens C. Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2000). Chúng tui xếp các chủng vi nấm có
đặc điểm như trong bảng 3.1 vào hai chi Aspergillus và Penicillium.
Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại tương ứng để xác định các chủng vi nấm
đến chi Aspergillus và chi Penicillium [6]
Một số đặc điểm chi Aspergillus Một số đặc điểm chi Penicillium
- Khuẩn lạc màu lục xám, xanh
xám, xám, luc, lục vàng, lục nâu,
nâu đen, trắng, vàng.
- Sợi nấm có vách ngăn, phân
nhánh, không màu hay màu nhạt.
- Bộ máy mang BTT không
nhánh
- Giá BTT phát triển từ tế bào
chân, không có hay có ít vách
ngăn.
- Bọng hình chuỳ, hình elíp, hình
nữa cầu hay hình cầu.
- Thể bình một tầng hay hai
tầng.
- BTT không có vách ngăn, mặt
ngoài nhẵn hay có gai, hoăc có
nốt sần.
- Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám
đôi khi có màu vàng, đỏ tím hay trắng.
- Mặt trái KL không màu hay có màu sắc khác
nhau.
- KL có hay không có vết khía xuyên tâm hay
đồng tâm, có hay không có các giọt tiết.
- KL có mặt dạng nhung hay mặt dạng len hay
xốp bông.
- Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu
hay màu nhạt, đôi khi màu sẫm.
- Bộ máy mang BTT hay không nhánh hay có
nhánh.
- Giá BTT với một vòng thể bình hay với hai đến
nhiều cuống thể bình ở phần ngọn giá.
- Thể bình có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần.
- BTT không có vách, hình cầu, gần cầu, hình
trứng, elíp đôi khi hình trụ, không màu hay màu
nhạt; mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai h...