berua.bega
New Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Luận văn ThS. Hóa Phân tích -- Trường đại học Khoa học tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2013
Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ; Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu; Thẩm định phương pháp đã xây dựng. Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN………………………………………………………....4
1.1 Giới thiệu chung [14-15]……………………………………………………….4
1.1.1 Định nghĩa………………………………………………………………..4
1.1.2 Tính chất hóa lý của Ochratoxins………………………………………..5
1.1.3 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép (MRL)………………………………7
1.2 Các phƣơng pháp xác định…………………………………………………..8
1.2.1 Phƣơng pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)……….8
1.2.2 Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC) ……………………9
1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn
dịch (IAC)……………………………………………………………………….9
1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ……………………………………10
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 12
2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu………………………………………….12
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………12
2.1.2 Nội dung nghiên cứu……………………………………………………12
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………..12
2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết mẫu………………………………………….12
2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………….13
2.2.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………………..13
2.2.2.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) ……….…………………………15
2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu……………………………………………………..20
2.3.1 Thiết bị, dụng cụ……………………………………….……………20
2.3.1.1 Thiết bị……………………………………………………………20
2.3.1.2 Dụng cụ…………………………………………………………..21
2.3.2 Dung môi, hóa chất…………………………………………………….21
2.3.3 Lấy mẫu………………………………………………………………….22
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….23
3.1 Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS………………………………..23
3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS…………………..23
3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ và ion con………………………………………..23
3.1.1.2 Tối ưu các điều kiện MS…………………………………………..24
3.1.2 Tối ƣu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)……….26
3.1.2.1 Pha tĩnh……………………………………………………………26
3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động…………………………………..27
3.1.2.3 Khảo sát tốc độ pha động...............................................................29
3.1.2.4 Chọn chương trình chạy gradient……………………………….…30
3.2 Tối ƣu quy trình xử lý mẫu…………………………………………………33
3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu………………………………………………33
3.2.2 Khảo sát thể tích (số lần chiết) dung môi chiết…………………….. 36
3.2.3 Chọn cột chiết pha rắn………………………………………………….36
3.2.4 Khảo sát tốc độ qua cột chiết pha rắn.......................................................37
3.2.5 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải………………………………….38
3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng pH trong quá trình chiết mẫu..................................38
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích………………………………………….42
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc………………………………………………42
3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)………………44
3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính……………………………………………45
3.3.4 Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………47
3.3.5 Độ chính xác (accuracy) của phƣơng pháp phân tích (độ đúng và độ
chụm) [9]………………………………………………………………………48
3.4 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………….52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………...57
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................59
PHỤ LỤC………………………………………………………………..…….......63
tạp. Do vậy chúng tui tiếp tục khảo sát so sánh giữa các quy trình chiết sau mỗi qui
trình làm lặp 3 mẫu và tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau:
100
lt
tt
C C
H (1)
Trong đó:
H: hiệu suất thu hồi (%)
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi OTs thu được (tính theo đường chuẩn) (ng/ml)
Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi OTs tính toán từ lượng chuẩn thêm vào (10
ng/ml)
Sử dụng phần mềm định lượng của máy, các mẫu được định dạng ở dạng
mẫu “quality control” với nồng độ biết trước là 10 ng/ml. Phần mềm sẽ tự động lập
đường chuẩn, tính toán nồng độ thực trong mẫu và đưa ra hiệu suất thu hồi theo
công thức trên.
Cân chính xác khoảng 5g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml. Thêm
100µl chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml, axit hóa bằng HCl 2% đến các pH khác nhau
trongkhoảng 1-9 (dùng giấy chỉ thị màu để nhận biết). Thêm 15 ml CHCl3, lắc
Vortex, ly tâm 6000 v/p trong 3 phút. Lấy lớp hữu cơ sang ống ly tâm khác. Phần
bã tiếp tục được chiết với 15 ml cloroform. Gộp dịch chiết vào ống ly tâm, thêm 10
ml NaHCO3 1%, lắc Vortex, ly tâm 6000 v/p trong 3 phút. Lấy lớp hữu cơ đem qua
cột chiết pha rắn C18. Cột chiết pha rắn được hoạt hóa bởi 5ml MeOH, 5 ml H2O.
Sau đó cột chiết được rửa tạp bằng 2 ml H2O, 2 ml MeOH:H2O (6:4). Chất phân
tích được rửa giải bằng 2 ml MeOH:CH3COOH (99,5:0,5,v/v). Dịch rửa giải được
chuyển vào vial đựng mẫu rồi bơm vào hệ thống LC-MS/MS (dịch có thể được lọc
trước khi đem đo trên máy bằng màng lọc mẫu cỡ 0,2 µm, nếu dịch bị đục).
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất...
Trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi
có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là phải âm
tính khi có mặt các chất có cấu trúc gần giống với chất phân tích. Trong phép phân
tích định lượng, là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh
hưởng của tất cả các yếu tố, nhằm hướng đến kết quả chính xác [9].
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân
tích một số hay nhiều chất trong một quy trình. Nếu chất cần phân tích phân biệt rõ
với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc [9].
Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký lỏng khối phổ chúng tui sử
dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) . Theo hội đồng Châu Âu
điểm IP (điểm nhận dạng- identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối
phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.
Bảng3.13: Ion mẹ và 2 ion con của các chất trong nhóm ochratoxins
Chuẩn Ion mẹ Ion con Số điểm IP
Ochratoxin A 402
358
4
166,9
Ochratoxin B 368
324
4
220
Như vậy phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu.
Hơn nữa để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu / chọn lọc
cao, chúng tui đã tiến hành phân tích các mẫu trắng. Kết quả cho thấy mẫu trắng
không cho tín hiệu phân tích.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Luận văn ThS. Hóa Phân tích -- Trường đại học Khoa học tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2013
Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ; Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu; Thẩm định phương pháp đã xây dựng. Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN………………………………………………………....4
1.1 Giới thiệu chung [14-15]……………………………………………………….4
1.1.1 Định nghĩa………………………………………………………………..4
1.1.2 Tính chất hóa lý của Ochratoxins………………………………………..5
1.1.3 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép (MRL)………………………………7
1.2 Các phƣơng pháp xác định…………………………………………………..8
1.2.1 Phƣơng pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)……….8
1.2.2 Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC) ……………………9
1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn
dịch (IAC)……………………………………………………………………….9
1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ……………………………………10
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 12
2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu………………………………………….12
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………12
2.1.2 Nội dung nghiên cứu……………………………………………………12
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………..12
2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết mẫu………………………………………….12
2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………….13
2.2.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………………..13
2.2.2.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) ……….…………………………15
2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu……………………………………………………..20
2.3.1 Thiết bị, dụng cụ……………………………………….……………20
2.3.1.1 Thiết bị……………………………………………………………20
2.3.1.2 Dụng cụ…………………………………………………………..21
2.3.2 Dung môi, hóa chất…………………………………………………….21
2.3.3 Lấy mẫu………………………………………………………………….22
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….23
3.1 Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS………………………………..23
3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS…………………..23
3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ và ion con………………………………………..23
3.1.1.2 Tối ưu các điều kiện MS…………………………………………..24
3.1.2 Tối ƣu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)……….26
3.1.2.1 Pha tĩnh……………………………………………………………26
3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động…………………………………..27
3.1.2.3 Khảo sát tốc độ pha động...............................................................29
3.1.2.4 Chọn chương trình chạy gradient……………………………….…30
3.2 Tối ƣu quy trình xử lý mẫu…………………………………………………33
3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu………………………………………………33
3.2.2 Khảo sát thể tích (số lần chiết) dung môi chiết…………………….. 36
3.2.3 Chọn cột chiết pha rắn………………………………………………….36
3.2.4 Khảo sát tốc độ qua cột chiết pha rắn.......................................................37
3.2.5 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải………………………………….38
3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng pH trong quá trình chiết mẫu..................................38
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích………………………………………….42
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc………………………………………………42
3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)………………44
3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính……………………………………………45
3.3.4 Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………47
3.3.5 Độ chính xác (accuracy) của phƣơng pháp phân tích (độ đúng và độ
chụm) [9]………………………………………………………………………48
3.4 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………….52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………...57
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................59
PHỤ LỤC………………………………………………………………..…….......63
tạp. Do vậy chúng tui tiếp tục khảo sát so sánh giữa các quy trình chiết sau mỗi qui
trình làm lặp 3 mẫu và tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau:
100
lt
tt
C C
H (1)
Trong đó:
H: hiệu suất thu hồi (%)
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi OTs thu được (tính theo đường chuẩn) (ng/ml)
Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi OTs tính toán từ lượng chuẩn thêm vào (10
ng/ml)
Sử dụng phần mềm định lượng của máy, các mẫu được định dạng ở dạng
mẫu “quality control” với nồng độ biết trước là 10 ng/ml. Phần mềm sẽ tự động lập
đường chuẩn, tính toán nồng độ thực trong mẫu và đưa ra hiệu suất thu hồi theo
công thức trên.
Cân chính xác khoảng 5g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml. Thêm
100µl chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml, axit hóa bằng HCl 2% đến các pH khác nhau
trongkhoảng 1-9 (dùng giấy chỉ thị màu để nhận biết). Thêm 15 ml CHCl3, lắc
Vortex, ly tâm 6000 v/p trong 3 phút. Lấy lớp hữu cơ sang ống ly tâm khác. Phần
bã tiếp tục được chiết với 15 ml cloroform. Gộp dịch chiết vào ống ly tâm, thêm 10
ml NaHCO3 1%, lắc Vortex, ly tâm 6000 v/p trong 3 phút. Lấy lớp hữu cơ đem qua
cột chiết pha rắn C18. Cột chiết pha rắn được hoạt hóa bởi 5ml MeOH, 5 ml H2O.
Sau đó cột chiết được rửa tạp bằng 2 ml H2O, 2 ml MeOH:H2O (6:4). Chất phân
tích được rửa giải bằng 2 ml MeOH:CH3COOH (99,5:0,5,v/v). Dịch rửa giải được
chuyển vào vial đựng mẫu rồi bơm vào hệ thống LC-MS/MS (dịch có thể được lọc
trước khi đem đo trên máy bằng màng lọc mẫu cỡ 0,2 µm, nếu dịch bị đục).
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất...
Trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi
có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả là phải âm
tính khi có mặt các chất có cấu trúc gần giống với chất phân tích. Trong phép phân
tích định lượng, là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh
hưởng của tất cả các yếu tố, nhằm hướng đến kết quả chính xác [9].
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân
tích một số hay nhiều chất trong một quy trình. Nếu chất cần phân tích phân biệt rõ
với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc [9].
Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký lỏng khối phổ chúng tui sử
dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) . Theo hội đồng Châu Âu
điểm IP (điểm nhận dạng- identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối
phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.
Bảng3.13: Ion mẹ và 2 ion con của các chất trong nhóm ochratoxins
Chuẩn Ion mẹ Ion con Số điểm IP
Ochratoxin A 402
358
4
166,9
Ochratoxin B 368
324
4
220
Như vậy phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu.
Hơn nữa để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu / chọn lọc
cao, chúng tui đã tiến hành phân tích các mẫu trắng. Kết quả cho thấy mẫu trắng
không cho tín hiệu phân tích.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
