bautroicuasao
New Member
LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục ....................................................................................................................... i Danh mục từ viết tắt ...................................................................................................v Danh mục bảng ........................................................................................................ vi Danh mục hình ........................................................................................................ vii Danh mục đồ thị .................................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Định nghĩa và thành phần ECM...........................................................................3
1.1.1. Định nghĩa ECM.........................................................................................3 1.1.2.Thành phần ECM.........................................................................................4 a. Nhóm protein cấu trúc..............................................................................4 b. Phức hợp protein - polysacharide ............................................................6 c. Nhóm protein bám dính ......................................................................... 6 d. Nhân tố tăng trưởng ................................................................................7 1.2. Quy trình thu nhận ECM......................................................................................8 1.2.1. Các phương pháp loại tế bào ......................................................................8 a. Phương pháp vật lí ...................................................................................8 b. Phương pháp hóa học...............................................................................9 c. Phương pháp enzyme .............................................................................11 d. Chất ức chế protease ..............................................................................12 1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn mô đến quá trình loại tế bào ................................12
Trang
ii
1.2.3. Kiểm tra sự loại bỏ tế bào.........................................................................12
1.2.4. Loại bỏ các hóa chất dư trên ECM ...........................................................13 1.3. Một số đặc tính sinh học của ECM....................................................................13
1.3.1. Đặc tính tự phân hủy .............................................................................13
1.3.2. Đặc tính kháng khuẩn............................................................................14
1.3.3. Đặc tính hóa hướng động ......................................................................14
1.3.4. Đặc tính tạo mạch..................................................................................15
1.4. Một số sản phẩm ECM thương mại và ứng dụng ..............................................15 1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu ........................................................................17
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................17
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.......................................................19
Chương 2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
2.1.Vật liệu – phương pháp.......................................................................................20 2.1.1. công cụ - thiết bị......................................................................................20 2.1.2. Hóa chất....................................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................24 2.2.1. Nguồn mẫu ...............................................................................................24 2.2.2 .Đối tượng nghiên cứu...............................................................................25 2.2.3. Phương pháp thu nhận ECM ....................................................................25
a. Thu nhận và nuôi cấy nguyên bào sợi................................................... 25 b. Nuôi cấy và tăng sinh nguyên bào sợi ................................................. 26 c. Đánh giá nguyên bào sợi .......................................................................26 d. Kích thích nguyên bào sợi tổng hợp protein tạo ECM ........................ 27 e. Phá tế bào thu nhận ECM .................................................................... 27
iii
2.2.4.Phương pháp đánh giá sự bám dính nhanh và tạo cụm ...........................28 a. Phân lập và nuôi nhân tế bào sừng từ mô da ....................................... 28 b. Đánh giá sự bám dính nhanh của tế bào trên ECM ............................. 29 c. Đánh giá sự tạo cụm tế bào trên ECM ................................................. 29
2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phục hồi tổn thương da chuột của ECM .........29 a. Xử lí màng ối thu nhận vật mang và tạo đĩa phủ vật mang ................. 30 b. Tạo ECM trên vật mang ....................................................................... 31 c. Khảo sát sự phục hồi tổn thương da chuột ............................................31
2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................................32
2.4. Xử lí số liệu .......................................................................................................33
Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.Kết quả thu nhận ECM......................................................................................34
3.1.1. Kết quả thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và đánh giá nguyên bào sợi thu nhận từ mô da .................................................................................. 34
3.1.2. Kết quả kích thích nguyên bào sợi tổng hợp ECM...............................36
3.1.3. Kết quả xử lí thu nhận ECM ..................................................................38
3.2.Kết quả đánh giá ECM......................................................................................42 3.2.1. Kết quả đánh giá thành phần ECM ........................................................42 3.2.2. Kết quả đánh giá sự bám dính của tế bào trên ECM.............................44 a. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của tế bào sừng trên ECM .... 44 b. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của nguyên bào sợi .............. 47 3.2.3. Kết quả sự tạo cụm tế bào của tế bào trên ECM ...................................49 3.3. Kết quả đánh giá khả năng của ECM lên sự phục hồi....................................52
3.3.1. Kết quả thu nhận vật mang từ màng ối...............................................52
3.3.2. Kết quả thu nhận ECM trên vật mang ................................................54
iv
3.3.3. Đánh giá sự phục hồi tổn thương bỏng da chuột ...............................54 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................................................................................. 57
TÀI LIỆU PHỤ LỤC Bảng PL 1. Bảng PL 2. Bảng PL 3. Bảng PL 4. Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử
THAM KHẢO ..................................................................................... 59
Tóm tắt một số sản phẩm ECM thu nhận từ mô, cơ quan ................ PL 1 Số nguyên bào sợi bám dính ............................................................ PL 5 Số tế bào sừng bám dính trên ........................................................... PL 6 Số cụm tế bào hình thành ................................................................. PL 7 lí thống kê số tế bào sừng bám trên đĩa nuôi không phủ ECM ......... PL 8 lí thống kê số tế bào sừng bám trên đĩa nuôi phủ ECM .................... PL 9 lí thống kê số nguyên bào sợi bám trên đĩa không phủ ECM ......... PL 10 lí thống kê số nguyên bào sợi bám trên đĩa nuôi phủ ECM ............ PL 11 lí thống kê số cụm tế bào................................................................. PL 12
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay nhu cầu cấy ghép cơ quan trong trị liệu là rất lớn, và thực tế là không có đủ nguồn mô, cơ quan. Vì vậy, nhu cầu tạo ra mô, cơ quan sử dụng cho cấy ghép trị liệu là rất cấp bách. Cùng với sự phát triển của khoa học, các nhà khoa học trong lĩnh vực công nghệ mô hi vọng việc nuôi cấy kết hợp các tế bào với các vật liệu sinh học có thể tái tạo lại bất kỳ mô và cơ quan trên cơ thể một lần nữa (de novo). Để tái tạo mô, cơ quan ngoài việc làm chủ nguồn tế bào còn phải thiết kế được cấu trúc sinh học giống như mô nhằm cố định, tạo hình cấu trúc để tế bào bám và tăng sinh. Cấu trúc sinh học này được gọi là khuôn ngoại bào. Khuôn ngoại bào nguyên được sử dụng làm khung sinh học để tái tạo cấu trúc các mô và cơ quan. Các khung ngoại bào này đã được thu nhận từ ruột non, da, gân, dây chằng, bàng quang... để tái tạo cấu trúc các mô này. Ngoài ra, các thành phần riêng rẽ của khuôn ngoại bào như collagen, laminin fibronectin hyaluronic acid đã được phân tách và sử dụng cả trong in vitro và in vivo để kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào.
Việc nuôi cấy tế bào trên các giá thể như phương pháp truyền thống (trên chai nhựa) cần thời gian cho tế bào bám dính và tăng sinh để đạt lớp đơn. Với giá thể là khuôn ngoại bào, có thể rút ngắn thời gian nuôi cấy mà vẫn có đủ lượng tế bào cho nghiên cứu.
Thêm nữa, nhờ đặc tính tăng cường sự bám dính của tế bào mà khuôn ngoại bào còn được sử dụng để thu nhận nhanh các tế bào có khả năng bám dính cũng như các tế bào bám dính chậm trong quần thể tế bào. Ngoài ra, khuôn ngoại bào còn tăng cường khả năng biệt hóa của tế bào và tạo ổ tế bào gốc in vitro, giữ cho các tế bào gốc không biệt hóa khi nuôi cấy in vitro. Đối với các ứng dụng lâm sàng, việc sử dụng khuôn ngoại bào sẽ giúp rút ngắn thời gian chờ ghép của bệnh nhân.
Vì vậy cần thiết xây dựng sớm quy trình “Thu nhận khuôn ngoại bào in vitro nhằm ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và trị liệu”
2
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Thu nhân được khuôn ngoại bào in vitro từ nguyên bào sợi người.
2. Xác định một số đặc tính sinh học (tăng cường sự bám dính nhanh và tạo
cụm tế bào) của khuôn ngoại bào.
3. Đánh giá sự phục hồi tổn thương da chuột của khuôn ngoại bào.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm vào Link, đợi vài giây sau đó bấm Get Website để tải:
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục ....................................................................................................................... i Danh mục từ viết tắt ...................................................................................................v Danh mục bảng ........................................................................................................ vi Danh mục hình ........................................................................................................ vii Danh mục đồ thị .................................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Định nghĩa và thành phần ECM...........................................................................3
1.1.1. Định nghĩa ECM.........................................................................................3 1.1.2.Thành phần ECM.........................................................................................4 a. Nhóm protein cấu trúc..............................................................................4 b. Phức hợp protein - polysacharide ............................................................6 c. Nhóm protein bám dính ......................................................................... 6 d. Nhân tố tăng trưởng ................................................................................7 1.2. Quy trình thu nhận ECM......................................................................................8 1.2.1. Các phương pháp loại tế bào ......................................................................8 a. Phương pháp vật lí ...................................................................................8 b. Phương pháp hóa học...............................................................................9 c. Phương pháp enzyme .............................................................................11 d. Chất ức chế protease ..............................................................................12 1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn mô đến quá trình loại tế bào ................................12
Trang
ii
1.2.3. Kiểm tra sự loại bỏ tế bào.........................................................................12
1.2.4. Loại bỏ các hóa chất dư trên ECM ...........................................................13 1.3. Một số đặc tính sinh học của ECM....................................................................13
1.3.1. Đặc tính tự phân hủy .............................................................................13
1.3.2. Đặc tính kháng khuẩn............................................................................14
1.3.3. Đặc tính hóa hướng động ......................................................................14
1.3.4. Đặc tính tạo mạch..................................................................................15
1.4. Một số sản phẩm ECM thương mại và ứng dụng ..............................................15 1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu ........................................................................17
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................17
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.......................................................19
Chương 2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
2.1.Vật liệu – phương pháp.......................................................................................20 2.1.1. công cụ - thiết bị......................................................................................20 2.1.2. Hóa chất....................................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................24 2.2.1. Nguồn mẫu ...............................................................................................24 2.2.2 .Đối tượng nghiên cứu...............................................................................25 2.2.3. Phương pháp thu nhận ECM ....................................................................25
a. Thu nhận và nuôi cấy nguyên bào sợi................................................... 25 b. Nuôi cấy và tăng sinh nguyên bào sợi ................................................. 26 c. Đánh giá nguyên bào sợi .......................................................................26 d. Kích thích nguyên bào sợi tổng hợp protein tạo ECM ........................ 27 e. Phá tế bào thu nhận ECM .................................................................... 27
iii
2.2.4.Phương pháp đánh giá sự bám dính nhanh và tạo cụm ...........................28 a. Phân lập và nuôi nhân tế bào sừng từ mô da ....................................... 28 b. Đánh giá sự bám dính nhanh của tế bào trên ECM ............................. 29 c. Đánh giá sự tạo cụm tế bào trên ECM ................................................. 29
2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phục hồi tổn thương da chuột của ECM .........29 a. Xử lí màng ối thu nhận vật mang và tạo đĩa phủ vật mang ................. 30 b. Tạo ECM trên vật mang ....................................................................... 31 c. Khảo sát sự phục hồi tổn thương da chuột ............................................31
2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................................32
2.4. Xử lí số liệu .......................................................................................................33
Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.Kết quả thu nhận ECM......................................................................................34
3.1.1. Kết quả thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và đánh giá nguyên bào sợi thu nhận từ mô da .................................................................................. 34
3.1.2. Kết quả kích thích nguyên bào sợi tổng hợp ECM...............................36
3.1.3. Kết quả xử lí thu nhận ECM ..................................................................38
3.2.Kết quả đánh giá ECM......................................................................................42 3.2.1. Kết quả đánh giá thành phần ECM ........................................................42 3.2.2. Kết quả đánh giá sự bám dính của tế bào trên ECM.............................44 a. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của tế bào sừng trên ECM .... 44 b. Kết quả đánh giá sự bám dính nhanh của nguyên bào sợi .............. 47 3.2.3. Kết quả sự tạo cụm tế bào của tế bào trên ECM ...................................49 3.3. Kết quả đánh giá khả năng của ECM lên sự phục hồi....................................52
3.3.1. Kết quả thu nhận vật mang từ màng ối...............................................52
3.3.2. Kết quả thu nhận ECM trên vật mang ................................................54
iv
3.3.3. Đánh giá sự phục hồi tổn thương bỏng da chuột ...............................54 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................................................................................. 57
TÀI LIỆU PHỤ LỤC Bảng PL 1. Bảng PL 2. Bảng PL 3. Bảng PL 4. Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử Kết quả xử
THAM KHẢO ..................................................................................... 59
Tóm tắt một số sản phẩm ECM thu nhận từ mô, cơ quan ................ PL 1 Số nguyên bào sợi bám dính ............................................................ PL 5 Số tế bào sừng bám dính trên ........................................................... PL 6 Số cụm tế bào hình thành ................................................................. PL 7 lí thống kê số tế bào sừng bám trên đĩa nuôi không phủ ECM ......... PL 8 lí thống kê số tế bào sừng bám trên đĩa nuôi phủ ECM .................... PL 9 lí thống kê số nguyên bào sợi bám trên đĩa không phủ ECM ......... PL 10 lí thống kê số nguyên bào sợi bám trên đĩa nuôi phủ ECM ............ PL 11 lí thống kê số cụm tế bào................................................................. PL 12
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay nhu cầu cấy ghép cơ quan trong trị liệu là rất lớn, và thực tế là không có đủ nguồn mô, cơ quan. Vì vậy, nhu cầu tạo ra mô, cơ quan sử dụng cho cấy ghép trị liệu là rất cấp bách. Cùng với sự phát triển của khoa học, các nhà khoa học trong lĩnh vực công nghệ mô hi vọng việc nuôi cấy kết hợp các tế bào với các vật liệu sinh học có thể tái tạo lại bất kỳ mô và cơ quan trên cơ thể một lần nữa (de novo). Để tái tạo mô, cơ quan ngoài việc làm chủ nguồn tế bào còn phải thiết kế được cấu trúc sinh học giống như mô nhằm cố định, tạo hình cấu trúc để tế bào bám và tăng sinh. Cấu trúc sinh học này được gọi là khuôn ngoại bào. Khuôn ngoại bào nguyên được sử dụng làm khung sinh học để tái tạo cấu trúc các mô và cơ quan. Các khung ngoại bào này đã được thu nhận từ ruột non, da, gân, dây chằng, bàng quang... để tái tạo cấu trúc các mô này. Ngoài ra, các thành phần riêng rẽ của khuôn ngoại bào như collagen, laminin fibronectin hyaluronic acid đã được phân tách và sử dụng cả trong in vitro và in vivo để kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào.
Việc nuôi cấy tế bào trên các giá thể như phương pháp truyền thống (trên chai nhựa) cần thời gian cho tế bào bám dính và tăng sinh để đạt lớp đơn. Với giá thể là khuôn ngoại bào, có thể rút ngắn thời gian nuôi cấy mà vẫn có đủ lượng tế bào cho nghiên cứu.
Thêm nữa, nhờ đặc tính tăng cường sự bám dính của tế bào mà khuôn ngoại bào còn được sử dụng để thu nhận nhanh các tế bào có khả năng bám dính cũng như các tế bào bám dính chậm trong quần thể tế bào. Ngoài ra, khuôn ngoại bào còn tăng cường khả năng biệt hóa của tế bào và tạo ổ tế bào gốc in vitro, giữ cho các tế bào gốc không biệt hóa khi nuôi cấy in vitro. Đối với các ứng dụng lâm sàng, việc sử dụng khuôn ngoại bào sẽ giúp rút ngắn thời gian chờ ghép của bệnh nhân.
Vì vậy cần thiết xây dựng sớm quy trình “Thu nhận khuôn ngoại bào in vitro nhằm ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và trị liệu”
2
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Thu nhân được khuôn ngoại bào in vitro từ nguyên bào sợi người.
2. Xác định một số đặc tính sinh học (tăng cường sự bám dính nhanh và tạo
cụm tế bào) của khuôn ngoại bào.
3. Đánh giá sự phục hồi tổn thương da chuột của khuôn ngoại bào.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm vào Link, đợi vài giây sau đó bấm Get Website để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: