hoang_khiem93
New Member
LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
TÓM LƯỢC
Với nền nông nghiệp phát triển lâu đời và phong phú như nước ta, có thể nói việc cung ứng các loại nguyên liệu trái cây không phải là khan hiếm về cả số lượng cũng như chất lượng; và đu đủ là loại cây ăn quả khá phổ biến, thân thuộc với người dân trên khắp đất nước. Tuy nhiên, đu đủ chỉ chủ yếu được sử dụng cho tươi sống nên giá trị kinh tế vẫn chưa cao vì thời gian bảo quản tương đối ngắn. Sự ra đời chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết và tinh khiết (một loại protease) thu nhận từ nhựa đu đủ xanh được xem như một phương pháp tích cực nhằm thúc đẩy giá trị của cây đu đủ vốn lâu đời này. Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành khảo sát khả năng trích ly enzyme từ nhựa đu đủ xanh và yếu tố bên ngoài (nhiệt độ, pH) ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân protein (casein) của papain trong khoảng nhiệt độ từ 30oC - 60oC, pH = 5,5 - 8,0. Từ đó có thể tìm ra được quy luật và nhiệt độ, pH thích hợp để enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, có khả năng trích ly và tinh chế chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh ở dạng bột mịn, trắng có độ ẩm thấp và bảo quản lạnh đông (-20 oC ) trong quá trình sử dụng.
Có sự tương tác qua lại giữa nhiệt độ và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................i DANH SÁCH HÌNH.....................................................................................vi DANH SÁCH BẢNG.................................................................................. vii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................1
1.1 Giới thiệu chung ......................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................2 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ ..........................................................................................2 2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ...........................................................................3 2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính............................................................................................3 2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm...............................................................................5 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng .........................................................................................6 2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain .....................................................8 2.4 Giới thiệu về cơ chất casein ...................................................................................9 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính papain (phương pháp Kunitz)......................11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...12 3.1 Phương tiện nghiên cứu........................................................................................12 3.1.1 Địa điểm, thời gian thực hiện ...........................................................................12 3.1.2 Nguyên liệu .......................................................................................................12 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm..........................................................................................12 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................................12 3.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................12 3.2.1 Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ.....................................................12 3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn ...........................................................13 3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1% ....................................................................14 3.3 Bố trí thí nghiệm....................................................................................................15 3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain .................................................15 3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của papain...15
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................17 4.1 Trích ly và tinh chế papain...................................................................................17
4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết..........................................................................18
4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................................................18
4.2.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ..........................................................................................................................20
4.2.3 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................23
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................26 5.1 Kết luận.................................................................................................................26 5.2 Đề nghị..................................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................27 PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..............................................v PHỤ LỤC 2 ................................................................................................ viii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tựa hình Trang
1
2
3
4
5
6
7 8
9
10
11
12 13
Cây đu đủ thu lấy nhựa .................................................................................... 2
Cấu trúc không gian của papain ....................................................................... 4
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain........................................... 7
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme .................................................. 7
Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết....................................... 14
Quy trình chuẩn bị dung dịch casein.............................................................. 14
Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết........................................................ 18 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain
bán tinh khiết trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau................................... 21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán
tinh khiết trong các điều kiện pH khác nhau.................................................. 23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain
bán tinh khiết ở điều kiện pH 5,5 và 8,0 ........................................................ 24 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ xử lý và pH lên hoạt tính
của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong nhựa đu đủ ..................... 26 Quy trình thí nghiệm xác định hoạt tính của papain ........................................ vi Đường chuẩn Tyrosine .................................................................................... vii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tựa bảng Trang
1 Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu....................... 3
2 Thành phần acid amin trong papain ................................................................. 4
3 Thành phần các acid amin có trong casein .................................................... 10
4 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ .............................. 20
5 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ ứng với từng pH... 20
6 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ...................................... 22
7 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ứng với từng nhiệt độ... 22
8 Hoạt tính enzyme (Tu/mg) ở các mẫu xử lý nhiệt độ và pH khác nhau ....... 25
9 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain .......................... viii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vii
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu chung
Với vô số công trình nghiên cứu, phát minh, thành tựu trong lĩnh vực khoa học ứng dụng, công nghệ sinh học ngày càng khẳng định vai trò khoa học mũi nhọn của mình từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay. Và công nghệ enzyme - một nhánh không phải là nhỏ bé và đơn giản của cây đại thụ công nghệ sinh học - cũng vì thế mà phát triển rực rỡ. Enzyme được biết đến như một chất xúc tác sinh học nổi trội bởi khả năng thúc đẩy vận tốc phản ứng của chúng.
Là một trong ba loại enzyme protease thu nhận từ nguồn gốc thực vật (enzyme tinh chế từ thực vật chỉ chiếm khoảng 4% tổng số enzyme thu nhận từ vi sinh vật, động vật và thực vật) - papain được nhiều người biết đến bởi khả năng thủy phân cơ chất protein mạnh mẽ và sâu sắc từ những bài thuốc sử dụng trong dân gian đến những công trình nghiên cứu đồ sộ với các chế phẩm tinh khiết hay bán tinh khiết trích ly từ nhựa trái đu đủ xanh. Vì thế, việc papain được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và cả lĩnh vực phi thực phẩm như y học, công nghiệp thuộc da, công nghệ xử lý chất thải,...cũng không phải là một điều khó hiểu.
Đu đủ là loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và tác dụng trị liệu. Đối với nước ta, đu đủ không phải là nguồn nguyên liệu khan hiếm nhưng lại chưa được tận dụng tốt để thu hiệu quả kinh tế cao, phần lớn là sử dụng dạng tươi sống. Vì vậy, tại sao chúng ta lại không dựa vào thế mạnh ấy mà phát triển chế phẩm enzyme papain có giá trị thương mại cao?
Tuy nhiên, giống như một số enzyme khác, hoạt tính xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố cả môi trường ngoài và nội tại, trong đó nhiệt độ và pH là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình tinh chế cũng như sử dụng papain trong các lĩnh vực khác nhau. Khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain là việc làm cần thiết, tạo cơ sở cho việc ứng dụng papain một cách hợp lý và hiệu quả nhất.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh cũng như khảo sát những tác động, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain đối với cơ chất casein. Từ đó, hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của papain theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ, nhằm ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm khác.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (danh pháp khoa học: Caricaceae, đồng nghĩa: Papayaceae) là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Cải (Brassicales), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Trung, Nam Mỹ và châu Phi, là một trong những loài Caricaceae được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới. Chúng là các loài cây bụi hay cây gỗ nhỏ thân xốp và mập, thường xanh, tuổi thọ thấp, cao tới 5-10m và không có cành, nhiều loài có quả ăn được. Cụm hoa mọc ở nách lá, kiểu xim hoa. Lá hình chân vịt hay xẻ thùy, mọc so le. Lá và quả xanh chứa nhựa mủ màu trắng. Quả mọng, lớn. Hạt có nội nhũ nhiều dầu. Gần đây đu đủ được trồng nhiều chủ yếu để lấy nhựa nhằm tinh chế enzyme papain có giá trị thương mại cao hơn đu đủ tiêu thụ dạng tươi. Đu đủ được xem là thực phẩm rất giàu vitamin C, A, E, K, các hợp chất folate và muối.
Hình 1: Cây đu đủ thu lấy nhựa
Ở Việt Nam, đu đủ được biết đến rất lâu bởi các tác dụng của nó trong việc chữa trị những bệnh thông thường như về đường tiêu hóa, chăm sóc sắc đẹp, đau lưng, viêm dạ dày mãn tính, ho do phế hư, tỳ vị hư nhược, chữa gai cột sống,... rất tốt. Ngoài ra, đu đủ là thực phẩm chứa nhiều carotenoids, chất này có khả năng chống oxy hóa mạnh, rất hữu ích trong việc phòng chống các bệnh tim mạch và ung thư, tăng sức đề kháng cho cơ thể nói chung và bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng, giúp da tươi nhuận.
Trong y học cổ truyền Nam Mỹ, đu đủ được đánh giá có hiệu lực trị bệnh tiểu đường, hen suyễn và chống ký sinh trùng đường ruột và điều trị hiệu quả bệnh ho lao nếu dùng đều đặn trong thời gian dài.
(Nguồn:
Đu đủ là cây trồng quen thuộc và được trồng khắp nơi ở Việt Nam nhưng do chủ yếu được tiêu thụ dạng tuơi sống như thực phẩm hằng ngày nên giá trị kinh tế rất thấp, trái cây thu hoạch lúc chín nên thời gian sử dụng và bảo quản không cao. Tuy nhiên, gần đây một số vùng thuộc miền Trung như Đắc Lắc được sự hỗ trợ của chương trình hợp tác với vương quốc Bỉ, trồng đu đủ để thu enzyme papain nên có bước phát triển khá cao, tạo thu nhập cho người dân và nguồn papain dồi dào cho sinh học ứng dụng.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Thành phần dinh dưỡng của đu đủ được thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu
Thành phần dinh dưỡng Nước
Năng lượng Cacbohydrat
Xơ
Tro Calcium Magie Postassium Sodium Vitamin C Folate Vitamin A Vitamin E Vitamin K
Hàm lượng 270,043 118,56 29,822 5,472
1,854 72,960 30,4 781,28 9,12 187,872 115,52 863,36 3,405 7,0
Đơn vị g
kcal g
g
g mg mg mg mg mg mcg
IU mg mg
(Nguồn:
2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính
i Cấu tạo
Nhựa đu đủ xanh là một hỗn hợp gồm nhiều protease như: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất, khoảng 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa và có ý nghĩa quan trọng nhất.
Có thể nói, tùy theo từng phương pháp phân tích mà số lượng acid amin có được trong phân tử papain có thể khác nhau. Nếu theo nghiên cứu của Hill và Smith, papain được cấu tạo từ 185 acid amin thì khi phân tích bằng tia X hiện đại hơn, papain lại chứa đến 212 acid amin, được ổn định bởi 3 cầu nối disufua hình thành từ 6 gốc cystein ở vị trí 22-63, 56-95, 153-200, ba cầu nối này không có chức năng sinh học mà chỉ tăng tính chất bền vững của cấu trúc phân tử và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25, trọng lượng phân tử khoảng 23406 Da. Nó có bộ ba xúc tác tạo thành bởi ba acid amin: cystein-25, histidine-159, asparagine-158.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Theo tác giả Nguyễn Đức Lượng, thành phần acid amin trong papain đu đủ như
sau:
Bảng 2: Thành phần acid amin trong papain
Amino acid Alanine Arginine Aspartic acid Haft – cystine Glutamic acid Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lycine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine
V aline
Methionine
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Số lượng 13
10
17
6
17
23
2
10
10
9
4
9
11
7
5
17
15
0
Cấu trúc không gian của phân tử papain có dạng cầu với kích thước: 26 x 48 x 36 A0, mạch chính bị gấp lại thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động chính nằm trên khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe.
Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với
các acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4
Hình 2: Cấu trúc không gian của papain
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ ii Hoạt tính
Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 - 8,0. Nhiệt độ thích hợp để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C. Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain; ứng với mỗi nguồn nguyên liệu và phương pháp tinh chế mà ta sẽ thu được các chế phẩm enzyme có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau.
Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là một endopeptidase vừa là một exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide.
RRRR (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) (-NH-CH-COOH-)i +(H2N-CH-CO-)k
Trong đó: i + k = n
Các exopeptidase thủy phân peptide chủ yếu thành acid amin
RRRR (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) n’H2N-CH-COOH+(H2N-CH-CO-)k’
Trongđó: n’+k’=n
So với các protease có nguồn gốc từ động vật hay vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn.
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm
Papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc. Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm các nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá cho papain là các chất có tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,... trong đó cystein là chất hay được dùng để hoạt hoá nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Sự hoạt hoá càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với các kim loại như EDTA.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá và EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Các chất này ức chế hoạt tính của enzyme bằng cách phản ứng với nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ 2 kể từ đầu mạch C là chất ức chế cạnh tranh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động. Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với tác nhân biến tính như dung môi hữu cơ.
Các chế phẩm enzyme sau khi bảo quản vài tháng có thể có độ hoạt động vào khoảng 30%. Ngay cả khi được hoạt hoá, lượng sulfhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1mol papain và thường không quá 0,5 mol/mol. Nguyên nhân là do nhóm sulfhydryl đã bị khóa chặt bất thuận nghịch một phần và bản chất hoá học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được giải thích một cách cụ thể.
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng
Mang bản chất là một protein nên phản ứng xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài môi trường như nhiệt độ, pH, các ion kim loại nặng,... và yếu tố nội tại gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, mức độ tinh khiết của papain được trích ly.
i Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ
Tuy có bản chất là protein nhưng papain lại có thể chịu nhiệt độ tương đối cao. Dạng chế phẩm enzyme khô khi được bảo quản trong điều kiện lạnh đông có thể không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 100oC thì nó sẽ mất hoạt tính hoàn toàn ngay cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch. Điều này được giải thích là do khi ở dạng dung dịch ta tăng lên đến nhiệt độ trên 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động của enzyme bị phá hủy hoàn toàn. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Một điều đặc biệt đáng chú ý là khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền thấp hơn cả papain trong nhựa nhựa, bởi lẽ trong nhựa nhựa còn có chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain tự nó mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hay oxy hoá. Khi thủy phân các protein khác nhau thì tuỳ từng trường hợp vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 6
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ thích hợp cho papain cũng khác nhau. Sự phụ thuộc giữa nhiệt độ và vận tốc phản
ứng được biểu thị ở hình 3.
Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain (Nguồn:
ii Ảnh hưởng của nhân tố pH
Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,2-8,2 và pH tối thích 6,0- 8,0 nhưng lại dễ bị biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hay trong môi trường kiềm mạnh có pH >12. Khi phản ứng với cơ chất thì tuỳ từng trường hợp vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ rất khác nhau. Điểm đẳng điện của papain là pI = 9. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme - cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác.
Hình 4: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme (Nguồn:
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 7
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ iii Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và kìm hãm
Papain chỉ thể hiện được hoạt tính xúc tác khi có nhóm –SH tự do, mà ở trạng thái thông thường, các phân tử papain lại liên kết với nhau bằng cầu nối S-S nên sẽ không thể hiện được nhóm –SH tự do, vì thế chất hoạt hóa sẽ có vai trò phá vỡ cầu nối S-S đó để tạo thành nhóm –SH tự do. Hoạt tính xúc tác của papain được thể hiện khi có sự tham gia của các hợp chất mang tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,...
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Người ta phân chia thành chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh.
Chất kìm hãm cạnh tranh thường là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho chổ kết hợp cần thiết của enzyme với cơ chất bị chiếm mất, cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm cho tốc độ phản ứng không tăng được.
Chất kìm hãm bất thuận nghịch đối với papain là các chất có khả năng phản ứng nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain, phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó, làm cho nó không thể gắn vào cơ chất được. Các chất này thường là các chất oxi hóa mạnh như: O2, O3, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Thông thường, trong các thí nghiệm xác định hoạt tính của papain, chất được sử dụng để ngừng phản ứng thủy phân xảy ra tiếp tục là TCA (Trichloroacetic acid - CCl3COOH) vì nó có khả năng ức chế rất nhanh phản ứng.
Chất kìm hãm không cạnh tranh sẽ kết hợp với enzyme ở một vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, tạo thành một phức hợp. Khi đó phức hợp này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme nhưng sau khi kết hợp với chất kìm hãm, chúng vẫn có khả năng tạo thành phức hợp khác với cơ chất.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain
Cũng giống như tính chất chung của các loại enzyme khác, phản ứng thủy phân của papain cũng theo ba giai đoạn sau:
Giai đoạn đầu: enzyme papain sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng v phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Khi tiến hành nghiên cứu đề tài này, để có kết quả khảo sát phù hợp với thực tế phải tiến hành thu nhận nguồn nhựa từ cùng một cây đu đủ và quả có độ tuổi thích hợp (10 tuần tuổi).
Từ các kết quả thu được trong quá trình khảo sát, có những nhận định sau:
• Chế phẩm enzyme bán tinh khiết papain sau khi trích ly phải được sấy khô đến độ ẩm an toàn (5%), nghiền mịn và bảo quản lạnh đông ở -200C để duy trì hoạt tính xúc tác. Không sử dụng lâu nguồn chế phẩm enzyme này (không quá hai tuần) vì sẽ bị giảm hoạt tính do sự tự phân hay oxy hóa.
• Có sự tương tác qua lại của nhiệt độ và pH môi trường xử lý lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất casein của enzyme papain trong nhựa đu đủ tươi. Papain hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 6,5 nếu phản ứng thủy phân xảy ra ở 300C, 350C, 400C, 450C; hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 7,5 nếu nếu phản ứng thủy phân ở 500C, 550C, 600C.
• Papain hoạt động tốt nhất ở 550C nếu pH môi trường là 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0 và ở 450C nếu pH môi trường 6,5.
• Hoạt tính cả enzyme thể hiện cao nhất ở mức độ tương tác khoảng nhiệt độ xử lý 50 - 600C và pH môi trường 6,5 - 7,5.
5.2 Đề nghị
Do thời gian tiến hành nghiên cứu hạn chế nên không thể khảo sát đầy đủ những tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của chế phẩm papain bán tinh khiết này. Những nghiên cứu có thể tiếp tục để hoàn thiện đề tài được đề nghị như sau:
• Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain với nhiều loại cơ chất khác nhau (casein, BSA, prrotein trứng,...);
• Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác của papain;
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
TÓM LƯỢC
Với nền nông nghiệp phát triển lâu đời và phong phú như nước ta, có thể nói việc cung ứng các loại nguyên liệu trái cây không phải là khan hiếm về cả số lượng cũng như chất lượng; và đu đủ là loại cây ăn quả khá phổ biến, thân thuộc với người dân trên khắp đất nước. Tuy nhiên, đu đủ chỉ chủ yếu được sử dụng cho tươi sống nên giá trị kinh tế vẫn chưa cao vì thời gian bảo quản tương đối ngắn. Sự ra đời chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết và tinh khiết (một loại protease) thu nhận từ nhựa đu đủ xanh được xem như một phương pháp tích cực nhằm thúc đẩy giá trị của cây đu đủ vốn lâu đời này. Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành khảo sát khả năng trích ly enzyme từ nhựa đu đủ xanh và yếu tố bên ngoài (nhiệt độ, pH) ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân protein (casein) của papain trong khoảng nhiệt độ từ 30oC - 60oC, pH = 5,5 - 8,0. Từ đó có thể tìm ra được quy luật và nhiệt độ, pH thích hợp để enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, có khả năng trích ly và tinh chế chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh ở dạng bột mịn, trắng có độ ẩm thấp và bảo quản lạnh đông (-20 oC ) trong quá trình sử dụng.
Có sự tương tác qua lại giữa nhiệt độ và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................i DANH SÁCH HÌNH.....................................................................................vi DANH SÁCH BẢNG.................................................................................. vii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................1
1.1 Giới thiệu chung ......................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................2 2.1 Giới thiệu về cây đu đủ ..........................................................................................2 2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ...........................................................................3 2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính............................................................................................3 2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm...............................................................................5 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng .........................................................................................6 2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain .....................................................8 2.4 Giới thiệu về cơ chất casein ...................................................................................9 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính papain (phương pháp Kunitz)......................11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...12 3.1 Phương tiện nghiên cứu........................................................................................12 3.1.1 Địa điểm, thời gian thực hiện ...........................................................................12 3.1.2 Nguyên liệu .......................................................................................................12 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm..........................................................................................12 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................................12 3.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................12 3.2.1 Phương pháp trích ly papain từ nhựa đu đủ.....................................................12 3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn ...........................................................13 3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1% ....................................................................14 3.3 Bố trí thí nghiệm....................................................................................................15 3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain .................................................15 3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của papain...15
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................17 4.1 Trích ly và tinh chế papain...................................................................................17
4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết..........................................................................18
4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................................................18
4.2.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ..........................................................................................................................20
4.2.3 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết.....................................................................................23
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................26 5.1 Kết luận.................................................................................................................26 5.2 Đề nghị..................................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................27 PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..............................................v PHỤ LỤC 2 ................................................................................................ viii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tựa hình Trang
1
2
3
4
5
6
7 8
9
10
11
12 13
Cây đu đủ thu lấy nhựa .................................................................................... 2
Cấu trúc không gian của papain ....................................................................... 4
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain........................................... 7
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme .................................................. 7
Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết....................................... 14
Quy trình chuẩn bị dung dịch casein.............................................................. 14
Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết........................................................ 18 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain
bán tinh khiết trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau................................... 21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán
tinh khiết trong các điều kiện pH khác nhau.................................................. 23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain
bán tinh khiết ở điều kiện pH 5,5 và 8,0 ........................................................ 24 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ xử lý và pH lên hoạt tính
của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong nhựa đu đủ ..................... 26 Quy trình thí nghiệm xác định hoạt tính của papain ........................................ vi Đường chuẩn Tyrosine .................................................................................... vii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tựa bảng Trang
1 Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu....................... 3
2 Thành phần acid amin trong papain ................................................................. 4
3 Thành phần các acid amin có trong casein .................................................... 10
4 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ .............................. 20
5 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo nhiệt độ ứng với từng pH... 20
6 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ...................................... 22
7 Sự thay đổi hoạt tính của enzyme (Tu/mg) theo pH ứng với từng nhiệt độ... 22
8 Hoạt tính enzyme (Tu/mg) ở các mẫu xử lý nhiệt độ và pH khác nhau ....... 25
9 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý và pH môi trường lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain .......................... viii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vii
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu chung
Với vô số công trình nghiên cứu, phát minh, thành tựu trong lĩnh vực khoa học ứng dụng, công nghệ sinh học ngày càng khẳng định vai trò khoa học mũi nhọn của mình từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay. Và công nghệ enzyme - một nhánh không phải là nhỏ bé và đơn giản của cây đại thụ công nghệ sinh học - cũng vì thế mà phát triển rực rỡ. Enzyme được biết đến như một chất xúc tác sinh học nổi trội bởi khả năng thúc đẩy vận tốc phản ứng của chúng.
Là một trong ba loại enzyme protease thu nhận từ nguồn gốc thực vật (enzyme tinh chế từ thực vật chỉ chiếm khoảng 4% tổng số enzyme thu nhận từ vi sinh vật, động vật và thực vật) - papain được nhiều người biết đến bởi khả năng thủy phân cơ chất protein mạnh mẽ và sâu sắc từ những bài thuốc sử dụng trong dân gian đến những công trình nghiên cứu đồ sộ với các chế phẩm tinh khiết hay bán tinh khiết trích ly từ nhựa trái đu đủ xanh. Vì thế, việc papain được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và cả lĩnh vực phi thực phẩm như y học, công nghiệp thuộc da, công nghệ xử lý chất thải,...cũng không phải là một điều khó hiểu.
Đu đủ là loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và tác dụng trị liệu. Đối với nước ta, đu đủ không phải là nguồn nguyên liệu khan hiếm nhưng lại chưa được tận dụng tốt để thu hiệu quả kinh tế cao, phần lớn là sử dụng dạng tươi sống. Vì vậy, tại sao chúng ta lại không dựa vào thế mạnh ấy mà phát triển chế phẩm enzyme papain có giá trị thương mại cao?
Tuy nhiên, giống như một số enzyme khác, hoạt tính xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố cả môi trường ngoài và nội tại, trong đó nhiệt độ và pH là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình tinh chế cũng như sử dụng papain trong các lĩnh vực khác nhau. Khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain là việc làm cần thiết, tạo cơ sở cho việc ứng dụng papain một cách hợp lý và hiệu quả nhất.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết từ nhựa đu đủ xanh cũng như khảo sát những tác động, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain đối với cơ chất casein. Từ đó, hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của papain theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ, nhằm ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm khác.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (danh pháp khoa học: Caricaceae, đồng nghĩa: Papayaceae) là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Cải (Brassicales), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Trung, Nam Mỹ và châu Phi, là một trong những loài Caricaceae được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới. Chúng là các loài cây bụi hay cây gỗ nhỏ thân xốp và mập, thường xanh, tuổi thọ thấp, cao tới 5-10m và không có cành, nhiều loài có quả ăn được. Cụm hoa mọc ở nách lá, kiểu xim hoa. Lá hình chân vịt hay xẻ thùy, mọc so le. Lá và quả xanh chứa nhựa mủ màu trắng. Quả mọng, lớn. Hạt có nội nhũ nhiều dầu. Gần đây đu đủ được trồng nhiều chủ yếu để lấy nhựa nhằm tinh chế enzyme papain có giá trị thương mại cao hơn đu đủ tiêu thụ dạng tươi. Đu đủ được xem là thực phẩm rất giàu vitamin C, A, E, K, các hợp chất folate và muối.
Hình 1: Cây đu đủ thu lấy nhựa
Ở Việt Nam, đu đủ được biết đến rất lâu bởi các tác dụng của nó trong việc chữa trị những bệnh thông thường như về đường tiêu hóa, chăm sóc sắc đẹp, đau lưng, viêm dạ dày mãn tính, ho do phế hư, tỳ vị hư nhược, chữa gai cột sống,... rất tốt. Ngoài ra, đu đủ là thực phẩm chứa nhiều carotenoids, chất này có khả năng chống oxy hóa mạnh, rất hữu ích trong việc phòng chống các bệnh tim mạch và ung thư, tăng sức đề kháng cho cơ thể nói chung và bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng, giúp da tươi nhuận.
Trong y học cổ truyền Nam Mỹ, đu đủ được đánh giá có hiệu lực trị bệnh tiểu đường, hen suyễn và chống ký sinh trùng đường ruột và điều trị hiệu quả bệnh ho lao nếu dùng đều đặn trong thời gian dài.
(Nguồn:
You must be registered for see links
- 25k)Đu đủ là cây trồng quen thuộc và được trồng khắp nơi ở Việt Nam nhưng do chủ yếu được tiêu thụ dạng tuơi sống như thực phẩm hằng ngày nên giá trị kinh tế rất thấp, trái cây thu hoạch lúc chín nên thời gian sử dụng và bảo quản không cao. Tuy nhiên, gần đây một số vùng thuộc miền Trung như Đắc Lắc được sự hỗ trợ của chương trình hợp tác với vương quốc Bỉ, trồng đu đủ để thu enzyme papain nên có bước phát triển khá cao, tạo thu nhập cho người dân và nguồn papain dồi dào cho sinh học ứng dụng.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Thành phần dinh dưỡng của đu đủ được thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của đu đủ có trong 304 g nguyên liệu
Thành phần dinh dưỡng Nước
Năng lượng Cacbohydrat
Xơ
Tro Calcium Magie Postassium Sodium Vitamin C Folate Vitamin A Vitamin E Vitamin K
Hàm lượng 270,043 118,56 29,822 5,472
1,854 72,960 30,4 781,28 9,12 187,872 115,52 863,36 3,405 7,0
Đơn vị g
kcal g
g
g mg mg mg mg mg mcg
IU mg mg
(Nguồn:
You must be registered for see links
) 2.2 Giới thiệu về papain trong đu đủ2.2.1 Cấu tạo và hoạt tính
i Cấu tạo
Nhựa đu đủ xanh là một hỗn hợp gồm nhiều protease như: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất, khoảng 95% tổng hàm lượng protease có trong nhựa và có ý nghĩa quan trọng nhất.
Có thể nói, tùy theo từng phương pháp phân tích mà số lượng acid amin có được trong phân tử papain có thể khác nhau. Nếu theo nghiên cứu của Hill và Smith, papain được cấu tạo từ 185 acid amin thì khi phân tích bằng tia X hiện đại hơn, papain lại chứa đến 212 acid amin, được ổn định bởi 3 cầu nối disufua hình thành từ 6 gốc cystein ở vị trí 22-63, 56-95, 153-200, ba cầu nối này không có chức năng sinh học mà chỉ tăng tính chất bền vững của cấu trúc phân tử và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25, trọng lượng phân tử khoảng 23406 Da. Nó có bộ ba xúc tác tạo thành bởi ba acid amin: cystein-25, histidine-159, asparagine-158.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Theo tác giả Nguyễn Đức Lượng, thành phần acid amin trong papain đu đủ như
sau:
Bảng 2: Thành phần acid amin trong papain
Amino acid Alanine Arginine Aspartic acid Haft – cystine Glutamic acid Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lycine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine
V aline
Methionine
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Số lượng 13
10
17
6
17
23
2
10
10
9
4
9
11
7
5
17
15
0
Cấu trúc không gian của phân tử papain có dạng cầu với kích thước: 26 x 48 x 36 A0, mạch chính bị gấp lại thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động chính nằm trên khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe.
Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với
các acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4
Hình 2: Cấu trúc không gian của papain
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ ii Hoạt tính
Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 - 8,0. Nhiệt độ thích hợp để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C. Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain; ứng với mỗi nguồn nguyên liệu và phương pháp tinh chế mà ta sẽ thu được các chế phẩm enzyme có khoảng pH, nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau.
Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là một endopeptidase vừa là một exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide.
RRRR (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) (-NH-CH-COOH-)i +(H2N-CH-CO-)k
Trong đó: i + k = n
Các exopeptidase thủy phân peptide chủ yếu thành acid amin
RRRR (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH) n’H2N-CH-COOH+(H2N-CH-CO-)k’
Trongđó: n’+k’=n
So với các protease có nguồn gốc từ động vật hay vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn.
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2.2 Cơ chế hoạt hóa và kìm hãm
Papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc. Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm các nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá cho papain là các chất có tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,... trong đó cystein là chất hay được dùng để hoạt hoá nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Sự hoạt hoá càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với các kim loại như EDTA.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá và EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Các chất này ức chế hoạt tính của enzyme bằng cách phản ứng với nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ 2 kể từ đầu mạch C là chất ức chế cạnh tranh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động. Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với tác nhân biến tính như dung môi hữu cơ.
Các chế phẩm enzyme sau khi bảo quản vài tháng có thể có độ hoạt động vào khoảng 30%. Ngay cả khi được hoạt hoá, lượng sulfhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1mol papain và thường không quá 0,5 mol/mol. Nguyên nhân là do nhóm sulfhydryl đã bị khóa chặt bất thuận nghịch một phần và bản chất hoá học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được giải thích một cách cụ thể.
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng
Mang bản chất là một protein nên phản ứng xúc tác của papain cũng chịu ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài môi trường như nhiệt độ, pH, các ion kim loại nặng,... và yếu tố nội tại gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, mức độ tinh khiết của papain được trích ly.
i Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ
Tuy có bản chất là protein nhưng papain lại có thể chịu nhiệt độ tương đối cao. Dạng chế phẩm enzyme khô khi được bảo quản trong điều kiện lạnh đông có thể không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 100oC thì nó sẽ mất hoạt tính hoàn toàn ngay cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch. Điều này được giải thích là do khi ở dạng dung dịch ta tăng lên đến nhiệt độ trên 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động của enzyme bị phá hủy hoàn toàn. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Một điều đặc biệt đáng chú ý là khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền thấp hơn cả papain trong nhựa nhựa, bởi lẽ trong nhựa nhựa còn có chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain tự nó mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hay oxy hoá. Khi thủy phân các protein khác nhau thì tuỳ từng trường hợp vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 6
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ thích hợp cho papain cũng khác nhau. Sự phụ thuộc giữa nhiệt độ và vận tốc phản
ứng được biểu thị ở hình 3.
Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của papain (Nguồn:
You must be registered for see links
)ii Ảnh hưởng của nhân tố pH
Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,2-8,2 và pH tối thích 6,0- 8,0 nhưng lại dễ bị biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hay trong môi trường kiềm mạnh có pH >12. Khi phản ứng với cơ chất thì tuỳ từng trường hợp vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ rất khác nhau. Điểm đẳng điện của papain là pI = 9. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme - cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác.
Hình 4: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme (Nguồn:
You must be registered for see links
)Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 7
Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ iii Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và kìm hãm
Papain chỉ thể hiện được hoạt tính xúc tác khi có nhóm –SH tự do, mà ở trạng thái thông thường, các phân tử papain lại liên kết với nhau bằng cầu nối S-S nên sẽ không thể hiện được nhóm –SH tự do, vì thế chất hoạt hóa sẽ có vai trò phá vỡ cầu nối S-S đó để tạo thành nhóm –SH tự do. Hoạt tính xúc tác của papain được thể hiện khi có sự tham gia của các hợp chất mang tính khử như: cystein, glutation acid, hydrocyanic, hydrogenuasulfite, sodiumthiosulfat,...
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Người ta phân chia thành chất kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh.
Chất kìm hãm cạnh tranh thường là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho chổ kết hợp cần thiết của enzyme với cơ chất bị chiếm mất, cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm cho tốc độ phản ứng không tăng được.
Chất kìm hãm bất thuận nghịch đối với papain là các chất có khả năng phản ứng nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain, phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó, làm cho nó không thể gắn vào cơ chất được. Các chất này thường là các chất oxi hóa mạnh như: O2, O3, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobezoate, cystine và các hoạt chất disulfua khác. Thông thường, trong các thí nghiệm xác định hoạt tính của papain, chất được sử dụng để ngừng phản ứng thủy phân xảy ra tiếp tục là TCA (Trichloroacetic acid - CCl3COOH) vì nó có khả năng ức chế rất nhanh phản ứng.
Chất kìm hãm không cạnh tranh sẽ kết hợp với enzyme ở một vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, tạo thành một phức hợp. Khi đó phức hợp này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme nhưng sau khi kết hợp với chất kìm hãm, chúng vẫn có khả năng tạo thành phức hợp khác với cơ chất.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3 Giới thiệu về phản ứng thủy phân của papain
Cũng giống như tính chất chung của các loại enzyme khác, phản ứng thủy phân của papain cũng theo ba giai đoạn sau:
Giai đoạn đầu: enzyme papain sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng v phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Khi tiến hành nghiên cứu đề tài này, để có kết quả khảo sát phù hợp với thực tế phải tiến hành thu nhận nguồn nhựa từ cùng một cây đu đủ và quả có độ tuổi thích hợp (10 tuần tuổi).
Từ các kết quả thu được trong quá trình khảo sát, có những nhận định sau:
• Chế phẩm enzyme bán tinh khiết papain sau khi trích ly phải được sấy khô đến độ ẩm an toàn (5%), nghiền mịn và bảo quản lạnh đông ở -200C để duy trì hoạt tính xúc tác. Không sử dụng lâu nguồn chế phẩm enzyme này (không quá hai tuần) vì sẽ bị giảm hoạt tính do sự tự phân hay oxy hóa.
• Có sự tương tác qua lại của nhiệt độ và pH môi trường xử lý lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất casein của enzyme papain trong nhựa đu đủ tươi. Papain hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 6,5 nếu phản ứng thủy phân xảy ra ở 300C, 350C, 400C, 450C; hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 7,5 nếu nếu phản ứng thủy phân ở 500C, 550C, 600C.
• Papain hoạt động tốt nhất ở 550C nếu pH môi trường là 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0 và ở 450C nếu pH môi trường 6,5.
• Hoạt tính cả enzyme thể hiện cao nhất ở mức độ tương tác khoảng nhiệt độ xử lý 50 - 600C và pH môi trường 6,5 - 7,5.
5.2 Đề nghị
Do thời gian tiến hành nghiên cứu hạn chế nên không thể khảo sát đầy đủ những tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của chế phẩm papain bán tinh khiết này. Những nghiên cứu có thể tiếp tục để hoàn thiện đề tài được đề nghị như sau:
• Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain với nhiều loại cơ chất khác nhau (casein, BSA, prrotein trứng,...);
• Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác của papain;
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: