Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……………………………………. 2
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin ……………………………………………... 2
1.1.1.1. Tính chất …………………………………………………………………... 2
1.1.1.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………….. 2
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3
1.1.2. Tổng quan về simvastatin …………………………………………………… 4
1.1.2.1. Tính chất …………………………………………………………………... 4
1.1.2.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………….. 5
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin..6
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .... 7
1.2.1. Khái niệm HPLC …………………………………………………………..... 7
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký …………………………………………..... 7
1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ………………………………………………. 8
1.2.4. Các thông số đặc trưng trong HPLC ………………………………………... 9
1.2.4.1. Hệ số phân bố K …………………………………………………………... 9
1.2.4.2. Thời gian lưu tR ………………………………………………………….... 9
1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’ ……………………………………………………... 10
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α …………………………………………………………. 10
1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ……………...…………. 10
1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết N ……………………………………………………….. 11
1.2.4.7. Độ phân giải RS ………………………………………………………….. 11
1.2.5. Ứng dụng của HPLC ………………………………………………………. 11
1.2.5.1. Định tính ………………………………………………………………… 11
1.2.5.2. Định lượng ………………………………………………………………. 12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………..… 14
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ …………...... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………... 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ………………………………………………….......… 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………..….. 15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………….... 16
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 16
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc …………………………………………. 16
2.3.3. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ………………………….…………. 16
2.3.4. Thẩm định phương pháp …………………………………………………... 17
2.3.4.1. Tính tương thích hệ thống ……………………………………………….. 17
2.3.4.2. Tính đặc hiệu / chọn lọc …………………………………………………. 17
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ………………………………...……… 18
2.3.4.4. Độ lặp ……………………………………………………………………. 18
2.3.4.5. Độ đúng …………………………………………………..……………… 19
2.3.4.6. Phương pháp xử lý kết quả ………………………………………………. 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……………………... 21
3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ………………………..…… 21
3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 21
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ………………………………………. 21
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……………………….. 22
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký ………………………………………………………... 22
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện …………………………………………...... 22
3.2.3. Lựa chọn pha động ………………………………………………………… 23
3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng ……………………………………………... 25
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP …………………………………………….. 26
3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống …………………………………...…… 26
3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp …………………………….……. 28
3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ………………………………………. 28
3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……………………………………… 30
3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ……………………………………….. 31
3.4. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM …………………………………………………………..... 33
3.5. BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………… 37
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………. 37
ĐỀ XUẤT ……………………………………………………………………...… 38
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở các nước trên thế giới
ngày càng đa dạng và phức tạp, tỉ lệ những người mắc các bệnh tim mạch, tiểu
đường, ung thư… ngày càng cao dần thay thế cho các bệnh nhiễm trùng trước đây.
Điều này là do sự thay đổi của khí hậu, thói quen sinh hoạt khi đời sống đang ngày
càng nâng cao. Việt Nam cũng không nằm ngoài quy luật này. Trước đây, mô hình
bệnh tật ở Việt Nam chủ yếu là các bệnh nhiễm trùng thì nay mô hình bệnh tật đã
hoàn toàn thay đổi: chỉ có 27% là các bệnh do vi trùng gây nên, có đến 62% các
bệnh không phải do vi trùng (các bệnh lây nhiễm do siêu vi trùng) như: huyết áp,
tâm thần, tim mạch, suy dinh dưỡng, tiểu đường... còn lại 11% loại bệnh do tai nạn
thương tích [4].
Theo số liệu của Cục Quản lý Dược, nguyên nhân gây tử vong chính ở Việt Nam
hiện nay thuộc về nhóm bệnh tim mạch (13%) [4]. Trong đó phải nói đến các bệnh
xơ vữa động mạch, với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu
cơ tim, nhồi máu não... Nguyên nhân chủ yếu là do các rối loạn lipid máu. Calci
atorvastatin và simvastatin là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng
nhiều hiện nay. Tuy nhiên, trong các tài liệu trong nước như DĐVN IV và một số
tài liệu nước ngoài chúng tui tham khảo [3, 12, 15, 16, 17, 23], chưa có nhiều
phương pháp chuẩn để định lượng hai chất này cũng như các statin khác hay quy
trình còn phức tạp. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng các statin
này là hết sức cần thiết.
Từ các cơ sở trên chúng tui tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời calci
atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với hai mục tiêu cụ thể sau:
Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin
1.1.1.1. Tính chất
a. Công thức cấu tạo [5, 23]
Calci atorvastatin là một thuốc trong nhóm statin, thuộc dẫn chất acid heptanoic
(không đóng vòng δ-lacton). Thuốc có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.1. Công thức cấu tạo calci atorvastatin
Công thức phân tử: C66H68CaF2N4O10
Phân tử lượng: 1155,34
Tên khoa học: Calcium (β R, δ R)-2-(p-fluorophenyl)-β, δ-dihydroxy-5-
isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)pyrrole-1-heptanoate (1:2), trihydrate
[344423-98-9]. Anhydrous [134523-03-8]
b. Tính chất vật lý [16, 21, 23]
Calci atorvastatin có dạng bột kết tinh trắng hay trắng nhạt. Tan nhiều trong
methanol, hơi tan trong rượu, không tan đến ít tan trong nước cất, đệm phosphat pH
7,4 và trong acetonitril
Hấp thụ UV với các cực đại hấp thụ ở 194, 224 và 246 nm
Nhiệt độ nóng chảy: 176oC – 178oC
Góc quay cực: [ - ]ߙ7,4o (C = 1 trong DMSO)
1.1.1.2. Tác dụng dược lý [10, 11]
Calci atorvastatin là một thuốc thuộc nhóm ức chế enzyme khử HMG CoA, hoạt
động bằng cách ức chế cạnh tranh men khử HMG CoA reductase – một enzyme xúc
tác cho phản ứng biến đổi 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG CoA)
thành mevalonate, đây là bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol
tại gan do đó làm giảm lượng cholesterol. Ức chế cạnh tranh với enzyme khử HMG
CoA làm giảm tổng hợp cholesterol, tăng biểu hiện của các thụ thể lipoprotein mật
độ thấp (thụ thể LDL) trên tế bào gan, điều này làm tăng hấp thu LDL bởi các tế
bào gan, làm giảm lượng LDL - cholesterol trong máu. Như các statin khác, calci
atorvastatin cũng làm giảm nồng độ triglyceride trong máu và hơi làm tăng lượng
HDL - cholesterol.
Dược động học: Calci atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống, với thời gian xấp
xỉ nồng độ tối đa (T max) 1 - 2 giờ. Sinh khả dụng tuyệt đối của thuốc là khoảng
14%, tỉ lệ gắn với protein cao (≥ 98%). Cơ chế chuyển hóa chính của calci
atorvastatin là thông qua cytochrom P450 3A4 hydroxyl để tạo thành ortho và
parahydroxylated hoạt động. Calci atorvastatin chủ yếu đào thải qua gan mật, có ít
hơn 2% thu hồi trong nước tiểu. Thời gian bán thải của thuốc là 14 giờ, hầu như
không có chu kỳ gan ruột.
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm
Phương pháp 1 [16]:
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động:
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1,54 g ammonium dihydrogen orthophosphat
vào 1000 ml nước, điều chỉnh pH về 4,0 bằng acid acetic băng.
+ Dung môi A: hỗn hợp của acetonitril : tetrahydrofuran (92,5 : 7,5)
+ Pha động là hỗn hợp của dung dịch đệm pH 4,0 và dung môi A với tỉ
lệ 50 : 50
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm
Phương pháp 2 [19]:
- Cột: cột thép không gỉ Waters Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
điều nhiệt cột ở 40 oC
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……………………………………. 2
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin ……………………………………………... 2
1.1.1.1. Tính chất …………………………………………………………………... 2
1.1.1.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………….. 2
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3
1.1.2. Tổng quan về simvastatin …………………………………………………… 4
1.1.2.1. Tính chất …………………………………………………………………... 4
1.1.2.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………….. 5
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin..6
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .... 7
1.2.1. Khái niệm HPLC …………………………………………………………..... 7
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký …………………………………………..... 7
1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ………………………………………………. 8
1.2.4. Các thông số đặc trưng trong HPLC ………………………………………... 9
1.2.4.1. Hệ số phân bố K …………………………………………………………... 9
1.2.4.2. Thời gian lưu tR ………………………………………………………….... 9
1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’ ……………………………………………………... 10
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α …………………………………………………………. 10
1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ……………...…………. 10
1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết N ……………………………………………………….. 11
1.2.4.7. Độ phân giải RS ………………………………………………………….. 11
1.2.5. Ứng dụng của HPLC ………………………………………………………. 11
1.2.5.1. Định tính ………………………………………………………………… 11
1.2.5.2. Định lượng ………………………………………………………………. 12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………..… 14
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ …………...... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………... 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ………………………………………………….......… 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………..….. 15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………….... 16
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 16
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc …………………………………………. 16
2.3.3. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ………………………….…………. 16
2.3.4. Thẩm định phương pháp …………………………………………………... 17
2.3.4.1. Tính tương thích hệ thống ……………………………………………….. 17
2.3.4.2. Tính đặc hiệu / chọn lọc …………………………………………………. 17
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ………………………………...……… 18
2.3.4.4. Độ lặp ……………………………………………………………………. 18
2.3.4.5. Độ đúng …………………………………………………..……………… 19
2.3.4.6. Phương pháp xử lý kết quả ………………………………………………. 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……………………... 21
3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ………………………..…… 21
3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 21
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ………………………………………. 21
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……………………….. 22
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký ………………………………………………………... 22
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện …………………………………………...... 22
3.2.3. Lựa chọn pha động ………………………………………………………… 23
3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng ……………………………………………... 25
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP …………………………………………….. 26
3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống …………………………………...…… 26
3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp …………………………….……. 28
3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ………………………………………. 28
3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……………………………………… 30
3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ……………………………………….. 31
3.4. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM …………………………………………………………..... 33
3.5. BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………… 37
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………. 37
ĐỀ XUẤT ……………………………………………………………………...… 38
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở các nước trên thế giới
ngày càng đa dạng và phức tạp, tỉ lệ những người mắc các bệnh tim mạch, tiểu
đường, ung thư… ngày càng cao dần thay thế cho các bệnh nhiễm trùng trước đây.
Điều này là do sự thay đổi của khí hậu, thói quen sinh hoạt khi đời sống đang ngày
càng nâng cao. Việt Nam cũng không nằm ngoài quy luật này. Trước đây, mô hình
bệnh tật ở Việt Nam chủ yếu là các bệnh nhiễm trùng thì nay mô hình bệnh tật đã
hoàn toàn thay đổi: chỉ có 27% là các bệnh do vi trùng gây nên, có đến 62% các
bệnh không phải do vi trùng (các bệnh lây nhiễm do siêu vi trùng) như: huyết áp,
tâm thần, tim mạch, suy dinh dưỡng, tiểu đường... còn lại 11% loại bệnh do tai nạn
thương tích [4].
Theo số liệu của Cục Quản lý Dược, nguyên nhân gây tử vong chính ở Việt Nam
hiện nay thuộc về nhóm bệnh tim mạch (13%) [4]. Trong đó phải nói đến các bệnh
xơ vữa động mạch, với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu
cơ tim, nhồi máu não... Nguyên nhân chủ yếu là do các rối loạn lipid máu. Calci
atorvastatin và simvastatin là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng
nhiều hiện nay. Tuy nhiên, trong các tài liệu trong nước như DĐVN IV và một số
tài liệu nước ngoài chúng tui tham khảo [3, 12, 15, 16, 17, 23], chưa có nhiều
phương pháp chuẩn để định lượng hai chất này cũng như các statin khác hay quy
trình còn phức tạp. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng các statin
này là hết sức cần thiết.
Từ các cơ sở trên chúng tui tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời calci
atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với hai mục tiêu cụ thể sau:
Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin
1.1.1.1. Tính chất
a. Công thức cấu tạo [5, 23]
Calci atorvastatin là một thuốc trong nhóm statin, thuộc dẫn chất acid heptanoic
(không đóng vòng δ-lacton). Thuốc có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.1. Công thức cấu tạo calci atorvastatin
Công thức phân tử: C66H68CaF2N4O10
Phân tử lượng: 1155,34
Tên khoa học: Calcium (β R, δ R)-2-(p-fluorophenyl)-β, δ-dihydroxy-5-
isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)pyrrole-1-heptanoate (1:2), trihydrate
[344423-98-9]. Anhydrous [134523-03-8]
b. Tính chất vật lý [16, 21, 23]
Calci atorvastatin có dạng bột kết tinh trắng hay trắng nhạt. Tan nhiều trong
methanol, hơi tan trong rượu, không tan đến ít tan trong nước cất, đệm phosphat pH
7,4 và trong acetonitril
Hấp thụ UV với các cực đại hấp thụ ở 194, 224 và 246 nm
Nhiệt độ nóng chảy: 176oC – 178oC
Góc quay cực: [ - ]ߙ7,4o (C = 1 trong DMSO)
1.1.1.2. Tác dụng dược lý [10, 11]
Calci atorvastatin là một thuốc thuộc nhóm ức chế enzyme khử HMG CoA, hoạt
động bằng cách ức chế cạnh tranh men khử HMG CoA reductase – một enzyme xúc
tác cho phản ứng biến đổi 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG CoA)
thành mevalonate, đây là bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol
tại gan do đó làm giảm lượng cholesterol. Ức chế cạnh tranh với enzyme khử HMG
CoA làm giảm tổng hợp cholesterol, tăng biểu hiện của các thụ thể lipoprotein mật
độ thấp (thụ thể LDL) trên tế bào gan, điều này làm tăng hấp thu LDL bởi các tế
bào gan, làm giảm lượng LDL - cholesterol trong máu. Như các statin khác, calci
atorvastatin cũng làm giảm nồng độ triglyceride trong máu và hơi làm tăng lượng
HDL - cholesterol.
Dược động học: Calci atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống, với thời gian xấp
xỉ nồng độ tối đa (T max) 1 - 2 giờ. Sinh khả dụng tuyệt đối của thuốc là khoảng
14%, tỉ lệ gắn với protein cao (≥ 98%). Cơ chế chuyển hóa chính của calci
atorvastatin là thông qua cytochrom P450 3A4 hydroxyl để tạo thành ortho và
parahydroxylated hoạt động. Calci atorvastatin chủ yếu đào thải qua gan mật, có ít
hơn 2% thu hồi trong nước tiểu. Thời gian bán thải của thuốc là 14 giờ, hầu như
không có chu kỳ gan ruột.
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm
Phương pháp 1 [16]:
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động:
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1,54 g ammonium dihydrogen orthophosphat
vào 1000 ml nước, điều chỉnh pH về 4,0 bằng acid acetic băng.
+ Dung môi A: hỗn hợp của acetonitril : tetrahydrofuran (92,5 : 7,5)
+ Pha động là hỗn hợp của dung dịch đệm pH 4,0 và dung môi A với tỉ
lệ 50 : 50
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm
Phương pháp 2 [19]:
- Cột: cột thép không gỉ Waters Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
điều nhiệt cột ở 40 oC
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links