Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ tandem LC-MS/MS
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1
Chương 1 - TỔNG QUAN...............................................................................................4
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ ...................................................................................4
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản..................................................................6
1.3. Đại cương về axít domoic (DA)........................................................................8
1.3.1. Tính chất hóa lý. .......................................................................................8
1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................8
1.3.3. Độc tính của DA .......................................................................................9
1.4. Một số phương pháp phân tích DA...................................................................9
1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................10
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS)..11
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương
pháp LC-MS/MS trong phân tích DA.............................................................12
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................12
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................12
1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] ........................12
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản.............................................13
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15
1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............23
1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký...................................................26
1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: ....................................................................................27
1.7.2. Chiết pha rắn SPE:..................................................................................27
Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................29
2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài.......................................................................29
2.2. Mô hình thực nghiệm ......................................................................................29
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:.............................................................................29
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: ....................................................................................29
2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ...............................................................................30
2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:.........................................................................30
2.5. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................31
2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS.....................................................31
2.5.2. Cột:..........................................................................................................31
2.5.3. Pha động và chế độ gradient:..................................................................32
2.5.4. Dung môi chiết:.......................................................................................32
2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: ................................................................................32
2.5.6. Tính toán : ...............................................................................................33
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ...................................................................33
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp:.....................................................33
2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp:...................................................................34
2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:................................................................34
2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể..................................35
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................36
3.1. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................36
3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS ..............................................36
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiii
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ...............................................40
3.1.3. Dung môi chiết:.......................................................................................45
3.2. Khoảng tuyến tính:..........................................................................................47
3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .............................................................49
3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .....................................................49
3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể....................................................51
3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................52
3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. ....................................................................54
3.7.1. Phạm vi áp dụng: ....................................................................................54
3.7.2. Nguyên tắc: .............................................................................................54
3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:...................................................54
3.7.4. Chuẩn bị mẫu:.........................................................................................57
3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: ............................................................................58
3.7.6. Đảm bảo chất lượng................................................................................60
3.7.7. Tính toán kết quả: ...................................................................................60
KẾT LUẬN....................................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62
PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN...................1
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU...........................4
PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH ......................................13
PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ...........19
PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
………….BẰNG HPLC –UV ........................................................................29iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
DA Axít domoic Axít Domoic
DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array
EU European Liên minh Châu Âu
FA Formic acid Axít Formic
FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang
HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS Liquid Chromatograph
Tandem Mass Spectrometer
Sắc ký lỏng ghép 2 lần
khối phổ
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng
NPLC Normal Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận
ND Not detected Không phát hiện
RPLC Reversed Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn
TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic
UV Ultra Violet Cực tím
VIS Visible Nhìn thấy
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiiv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Diễn giải Trang
Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .....................................................26
Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm ..........................................................................30
Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản........................................36
Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone................................................37
Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm.......................................................38
Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm ............39
Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1.............................................................40
Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1....................................................................41
Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42
Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43
Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44
Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 pPhần mềm ...........................47
Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark
not defined.
Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49
Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49
Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51
Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình Diễn giải Trang
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16
Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17
Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm ....................................................................17
Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .................................................................18
Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .............................................................19
Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử..............................................................................20
Hình 07. Bộ ion hóa hóa học.....................................................................................20
Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực ..............................................................................22
Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS..................................................23
Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18...............................................................24
Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24
Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. ..............25
Hình 14. Mô hình thực nghiệm.................................................................................29
Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37
Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V...............38
Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .....................................................................39
Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40
Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 ....................................41
Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 ....................................42
Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 ....................................43
Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 ....................................44
Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 ....................................45
Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46
Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46
Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47
Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48
Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53
Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất
nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên
trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới
bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các
nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ
USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ
quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng
đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm
gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong
công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước
ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản
phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm
2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD.
Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam
là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,
để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm
bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan
quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là
tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm
tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất
khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình
giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo
vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải
được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng
với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích.
Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh
vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt
Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên2
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là
định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và
phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây
tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ).
Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có
công thức cấu tạo:
Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù
hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm
soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn
liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine
đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích
để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên
cứu của một số tổ chức khoa học hay tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương
pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLCUV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa
có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề
nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể
áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với
điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … )
là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan
chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất
khẩu.
Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi
tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP
(Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn
thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.4
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ
Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản
xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động
vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần
lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ
trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được
phát hiện trên thế giới thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp
(Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa
các độc tố gây hại cho sinh vật khác.
Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi
nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các
quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước. Sự đổi màu nước tự
nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hay xanh vàng ở các
vùng nước rộng lớn diễn ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các
loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ
gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các
sắc tố đỏ phycoerythrin ...
“Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó
gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm,
cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong.
Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự
kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hay một số loài tảo độc hại đạt tới
mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác.
Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau:
a. Các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu
nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở
hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương
sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium
erythraeum (tảo lam).
b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được
thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về
thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như:
Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp:
Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra.
Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp
Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra.
Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê
Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... sản sinh
ra.
Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu
sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... sản
sinh ra.
Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài
Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... sản sinh
ra.
Độc tố Các độc tố tảo lam do các loài tảo lam Anabaena circinalis,
Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... sản sinh ra.
c. Các loài không độc với người nhưng lại độc với cá và các động vật
không xương sống (đặc biệt trong các hệ thống nuôi thâm canh) do phá hủy
hay làm tắc các mang của chúng; bao gồm các loài tảo khuê Chaetoceros
convolutus, tảo giáp Gymnodinium mikimotoi,... gây nên.
Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở mật độ thấp chưa làm thay đổi
màu nước, chẳng hạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP được
phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấp hơn 103 tế bào/lít,
trong khi các tảo khác thường gây hại khi chúng xuất hiện ở các mật độ cao
hơn, làm thay đổi màu nước và kết quả là gây nên thủy triều đỏ. Loài6
Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động vật đáy ở mật độ cao hơn 107
tế bào/lít (Andersen, 1996).
Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã
thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal,
Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6
người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ
độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài
Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư. ở Monte
Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm
chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides).
Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển
Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là
từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa
trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt với tổng số thiệt hại là 4.452 triệu
yên, v.v.
Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã
được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực
vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng
20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et
al., 1996).
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản
a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù
du. Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc
chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:
Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20
loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới
1 mg. Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong nước.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi7
Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc
tố có khối lượng phân tử lớn, bao gồm axit okadaic, dinophysis,
pectenotoxins và yessotoxin.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ tandem LC-MS/MS
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1
Chương 1 - TỔNG QUAN...............................................................................................4
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ ...................................................................................4
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản..................................................................6
1.3. Đại cương về axít domoic (DA)........................................................................8
1.3.1. Tính chất hóa lý. .......................................................................................8
1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................8
1.3.3. Độc tính của DA .......................................................................................9
1.4. Một số phương pháp phân tích DA...................................................................9
1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................10
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS)..11
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương
pháp LC-MS/MS trong phân tích DA.............................................................12
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................12
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................12
1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] ........................12
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản.............................................13
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15
1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............23
1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký...................................................26
1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: ....................................................................................27
1.7.2. Chiết pha rắn SPE:..................................................................................27
Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................29
2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài.......................................................................29
2.2. Mô hình thực nghiệm ......................................................................................29
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:.............................................................................29
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: ....................................................................................29
2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ...............................................................................30
2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:.........................................................................30
2.5. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................31
2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS.....................................................31
2.5.2. Cột:..........................................................................................................31
2.5.3. Pha động và chế độ gradient:..................................................................32
2.5.4. Dung môi chiết:.......................................................................................32
2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: ................................................................................32
2.5.6. Tính toán : ...............................................................................................33
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ...................................................................33
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp:.....................................................33
2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp:...................................................................34
2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:................................................................34
2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể..................................35
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................36
3.1. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................36
3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS ..............................................36
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiii
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ...............................................40
3.1.3. Dung môi chiết:.......................................................................................45
3.2. Khoảng tuyến tính:..........................................................................................47
3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .............................................................49
3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .....................................................49
3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể....................................................51
3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................52
3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. ....................................................................54
3.7.1. Phạm vi áp dụng: ....................................................................................54
3.7.2. Nguyên tắc: .............................................................................................54
3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:...................................................54
3.7.4. Chuẩn bị mẫu:.........................................................................................57
3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: ............................................................................58
3.7.6. Đảm bảo chất lượng................................................................................60
3.7.7. Tính toán kết quả: ...................................................................................60
KẾT LUẬN....................................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62
PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN...................1
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU...........................4
PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH ......................................13
PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ...........19
PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
………….BẰNG HPLC –UV ........................................................................29iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
DA Axít domoic Axít Domoic
DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array
EU European Liên minh Châu Âu
FA Formic acid Axít Formic
FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang
HPLC High Performance Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS/MS Liquid Chromatograph
Tandem Mass Spectrometer
Sắc ký lỏng ghép 2 lần
khối phổ
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng
NPLC Normal Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận
ND Not detected Không phát hiện
RPLC Reversed Phase Liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn
TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic
UV Ultra Violet Cực tím
VIS Visible Nhìn thấy
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiiv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Diễn giải Trang
Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .....................................................26
Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm ..........................................................................30
Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản........................................36
Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone................................................37
Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm.......................................................38
Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm ............39
Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1.............................................................40
Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1....................................................................41
Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42
Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43
Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44
Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 pPhần mềm ...........................47
Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark
not defined.
Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49
Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49
Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51
Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình Diễn giải Trang
Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16
Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17
Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm ....................................................................17
Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .................................................................18
Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .............................................................19
Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử..............................................................................20
Hình 07. Bộ ion hóa hóa học.....................................................................................20
Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực ..............................................................................22
Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS..................................................23
Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18...............................................................24
Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24
Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. ..............25
Hình 14. Mô hình thực nghiệm.................................................................................29
Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37
Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V...............38
Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .....................................................................39
Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40
Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 ....................................41
Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 ....................................42
Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 ....................................43
Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 ....................................44
Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 ....................................45
Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46
Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46
Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47
Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48
Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53
Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất
nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên
trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới
bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các
nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ
USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ
quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng
đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm
gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong
công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước
ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản
phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm
2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD.
Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam
là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,
để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm
bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan
quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là
tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm
tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất
khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình
giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo
vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải
được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng
với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích.
Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh
vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt
Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên2
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là
định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và
phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây
tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ).
Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có
công thức cấu tạo:
Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù
hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm
soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn
liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine
đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích
để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên
cứu của một số tổ chức khoa học hay tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương
pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLCUV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa
có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề
nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể
áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với
điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … )
là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan
chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất
khẩu.
Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi
tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP
(Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn
thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.4
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ
Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản
xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động
vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần
lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ
trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được
phát hiện trên thế giới thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp
(Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa
các độc tố gây hại cho sinh vật khác.
Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi
nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các
quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước. Sự đổi màu nước tự
nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hay xanh vàng ở các
vùng nước rộng lớn diễn ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các
loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ
gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các
sắc tố đỏ phycoerythrin ...
“Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó
gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm,
cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong.
Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự
kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hay một số loài tảo độc hại đạt tới
mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác.
Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau:
a. Các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu
nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở
hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương
sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium
erythraeum (tảo lam).
b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được
thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về
thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như:
Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp:
Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra.
Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp
Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra.
Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê
Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... sản sinh
ra.
Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu
sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... sản
sinh ra.
Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài
Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... sản sinh
ra.
Độc tố Các độc tố tảo lam do các loài tảo lam Anabaena circinalis,
Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... sản sinh ra.
c. Các loài không độc với người nhưng lại độc với cá và các động vật
không xương sống (đặc biệt trong các hệ thống nuôi thâm canh) do phá hủy
hay làm tắc các mang của chúng; bao gồm các loài tảo khuê Chaetoceros
convolutus, tảo giáp Gymnodinium mikimotoi,... gây nên.
Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở mật độ thấp chưa làm thay đổi
màu nước, chẳng hạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP được
phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấp hơn 103 tế bào/lít,
trong khi các tảo khác thường gây hại khi chúng xuất hiện ở các mật độ cao
hơn, làm thay đổi màu nước và kết quả là gây nên thủy triều đỏ. Loài6
Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động vật đáy ở mật độ cao hơn 107
tế bào/lít (Andersen, 1996).
Những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã
thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal,
Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6
người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ
độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài
Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư. ở Monte
Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm
chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides).
Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển
Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là
từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa
trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt với tổng số thiệt hại là 4.452 triệu
yên, v.v.
Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã
được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực
vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng
20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et
al., 1996).
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản
a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù
du. Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc
chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:
Độc tố gây liệt cơ (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20
loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượng gây chết cho người là từ 0,1 tới
1 mg. Các độc tố PSP bền với nhiệt và có thể tan trong nước.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi7
Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc
tố có khối lượng phân tử lớn, bao gồm axit okadaic, dinophysis,
pectenotoxins và yessotoxin.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: