yenlinh_vu85
New Member
Download miễn phí Vai trò của công nghệ sinh học trong bảo vệ môi trường
Đểtạo được một plasmid vừa có khảnăng dẫn truyền (cloning plasmid
vector), từplasmid tổtiên, trước tiên người ta tiếp tục đưa vào những vùng mới,
đặc biệt là vùng chứa tổhợp gen chỉthịnào đó (chẳng hạn gen chỉthịlà gen
kháng tetracyclin hay tổhợp gen sản xuất các loại protein nhất định), mà thông
thường trong gen đó lại có một dãy các vịtrí cắt của RE (dãy này được gọi là
polylinker hay multiple cutting site-MCS). Đó là nơi đểthực hiện các thao tác
cắt, nối, ghép DNA, hay còn gọi là tái tổhợp DNA. Nguyên lý chọn lọc được
dòng tếbào chủtiếp nhận plasmid tái tổhợp được dựa trên nguyên lý kháng
kháng sinh hay đặc tính hình thành màu khuẩn lạc do không có sựtổng hợp loại
protein chỉthịtrên
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
một đoạn DNA có độ dài từ vài chục đến vài chục nghìnnucleotide, thông thường đến 3000. Vì lẫn tạp nhiều thành phần khác tham gia
phản ứng PCR, nên sau khi được sản phẩm PCR, trước hết cần kiểm tra độ dài
của đoạn DNA trong sản phẩm có đúng với đoạn ước định cần có không bằng
phương pháp điện di khuếch tán trên thạch (agarose gel electrophoresis). Sau
đó, cần thiết phải được tinh khiết trước khi sử dụng làm vật liệu DNA cho kỹ
thuật tái tổ hợp gen.
- Phương pháp điện di:
Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid có thể được tinh sạch nhờ một
số kỹ thuật như siêu ly tâm, sắc ký, hay điện di.
Phương pháp điện di được sử dụng cả trong phân tích định tính và thu
nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính
cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên
khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực
dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới
tác động của điện trường được tính theo công thức:
Log u = Log uo- KrC
Trong đó: Log uo là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, Kr
là hằng số làm chậm do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng
của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel.
Vì vậy, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai yếu tố: khối lượng
phân tử tức là số lượng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng
độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu nucleic
acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ
các chất tạo thành gel tuỳ từng trường hợp kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid
cần phân tách.
Bảng 1. Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách
% acrylamide
4
5
8
11
Kích thước các đoạn cần phân tách
(cặp nucleotide)
200-800
80-200
40-100
10-50
% agarose
0.6-0.8
0.9-1.2
1.2-1.5
Kích thước các đoạn cần phân tách
(kb)
1-20
0.5-7
0.2-5
§ Gel agarose:
Là loại gel thông dụng nhất bởi thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách
những đoạn có kích thước 0.5-20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang
và điện di được thực hiện thep phương nằm ngang. Sau điện di, các nucleic acid
trong gel agarose sẽ hiện hình ở dạng những vạch màu đỏ cam dưới tia tử ngoại
(UV có λ=300 nm) nhờ sự có mặt của ethidium bromide (được cho vào gel
trước khi đổ)-có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới
tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Bên cạnh đó, để ước lượng kích
thước của các trình tự nucleic acid trong gel agarose, thường dùng một yếu tố
đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker). Đây là một tập hợp
nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết trước được gọi là thang DNA (DNA
ladder), thông thường sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thuỷ giải
bởi enzyme giới hạn Hind III.
§ Gel acrylamide:
Được dùng để tách các đoạn kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base. Thao tác
với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose, nên chỉ được sử dụng cho
những mục đích đặc hiệu như:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base.
Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng
đứng. Nguyên tắc của loại điện di này là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường
trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA
phải tự định hướng lại. Phân tử có kích thước càng lớn thì thời gian tự đinh
hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử kích thước nhỏ.
Một DNA đơn giản có thể tạo ra chỉ một ít băng. Nếu DNA ban đầu là rất
lớn và phức tạp, việc nhuộm gel sẽ cho thấy một băng thay mặt cho sự biến thiên
hầu như là liên tục về kích thước của đoạn. Băng hay là phần chứa đoạn mong
muốn sẽ được định vị với kỹ thuật Southern blotting và được chuyển ra. Bởi vì
một một băng có thể thay mặt cho một hỗn hợp vài đoạn, nó được điện di trên
một gel với một nồng độ khác nhau để tách các đoạn có kích thước tương tự.
- Thu nhận acid nucleic:
Điện di trên gel agarose còn được sử dụng để thu nhận mẫu. Sau khi điện
di, các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại
theo một trong các phương pháp sau:
Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA
được thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch
đệm thích hợp.
Phương pháp 2: Một giếng nhỏ được khoét trong agarose ngay trước
vạch DNA. Giếng này được bơm dầy dung dịch đệm và điện trường được
tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm và được thu
nhận lại.
Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc
biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65oC). Sau điện di, vạch DNA được cắt
ra, ủ ở trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 65oC. Khi agarose đã hoàn
toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và
tủa.
b) Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền
Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi
nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số luợng phage tăng lên đến hàng
triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tượng
này có thể là do DNA của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt
khi vừa mới xâm nhập. Hệ thống bảo vệ này là các RE. DNA vi khuẩn không
bị chính các RE của chúng cắt là nhờ cơ chế gắn nhóm methyl vào A hay C ở
các vị trí cắt của các RE bởi enzyme methylase . Khi đó RE không còn nhận
biết được các vị trí cắt. Đây chính là hiện tượng giới hạn và các RE hợp thành
hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote.
Các RE là các endonuclease có khả năng nhận biết và cắt DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định, và được ứng dụng chủ yếu
trong phương pháp tạo dòng.
•....... Ví dụ về RE:
EcoRI là enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli
↓
EcoRI 5’G A ATT C3’
3’C TTA A G5’
↑
(Dấu mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí cắt)
Các enzyme thông dụng khác:
- Các polymerase: gồm 2 nhóm:
Các DNA polymerase xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. Phần
lớn các DNA polymerase dùng DNA làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp DNA
(DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA
polymerase đặc biệt là enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) laị sử
dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Cuối cùng là Terminal transferase)- một
DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà chỉ thêm các
nucleotide vào đầu của một phân tử DNA đã có sẵn. Các DNA polymerase, để
hoạt động, phải cần một mồi (primer). Mồi là một đoạn oligonucleotide bắt cặp
bổ sung với phần đầu của khuôn, để từ đó các polymerase mới nối dài tạo cặp
bổ sung.
Các RNA polymerase tham gia ...