Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm
– Môi trường sản sinh proteaza: môi trường NA có bổ sung 10% sữa.
II Phương pháp nghiên cứu:
II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các loài Bacillus subtilis, Bacillus linchenifomis, Bacillus megaterium (PA, G1, D2).
II.1.1 Đặc điểm hình thái:
• Phương pháp nhuộm gram, soi kính hiển vi: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy 24 – 48h bôi lên phiến kính rồi để khô. Cố định bôi bằng cách hơ phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhuộm bằng dung dịch Crystal violet 1 phút, rửa lại bằng cồn. Tráng nước, làm khô vết bôi và nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fusin loãng trong 1–2 phút. Rửa lại bằng nước, làm khô rồi đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000x. Nừu thấy vi khuẩn màu hồng là vi khuẩn G–, còn nếu là màu tím thì đó là vi khuẩn G+.
II.1.2 Đặc điểm sinh hoá
• khả năng sinh proteaza: Sữa tách béo 10% thanh trùng để riêng. Cờy các chủng Bacillus dưới dạng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường NA có bổ sung 10% sữa đã tách béo, nuôi 24 giờ ở tủ ấm 370C. Quan sát bán kính vòng thủy phân trong suốt xung quanh khuẩn lạc.
• khả năng sinh amylaza: Cờy các chủng từng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường đã có bổ sung 2% tinh bột tan. Sau 1 ngày nuôi trong tủ ấm 370C lấy ra rồi nhỏ dung dịch lugol. Quan sát bán kính vòng thuỷ phân, nếu các chủng có khả năng phân huỷ tinh bột chúng sẽ tạo thành một vòng trong suốt xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển, còn nếu quanh khuẩn lạc mà chỉ toàn màu xanh tím thì vi khuẩn không có khả năng phân huỷ tinh bột.
• Khả năng đối kháng với Vibrio: Đun sôi 2 bình, mỗi bình chứa 15 ml môi trường NA, đổ ra đĩa, để nguội tới 450C. Bổ sung vào bình thứ nhất 110l Vibrio parahaemolytiscus, bình thứ hai 110l Vibrio fuonissii. Cờy chấm điểm các chủng Bacillus trên hai đĩa thạch trên, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chủng nào có khả năng đối kháng sẽ tạo ra vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc của nó. Các chủng thử nghiệm và vi sinh vật gây bệnh đều đã được hoạt hoá trước khi cấy.
• Khả năng chịu mặn: các chủng Bacillus được nuôi trong môi trường NB có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau từ 1 – 10% w/v, nuôi trong điều kiện lắc hay để tĩnh ở 370C trong 1 ngày đêm. Sau đó đếm số khuẩn lạc hay đo mật độ quang OD để đánh giá sị phát triển của các chủng sau thời gian nuôi cấy.
II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối:
Các chủng Bacillus được bảo quản trong các ống efedos, sau đó được hoạt hoá trên môi trường NA trong đĩa petri.
Nhân giống cấp 1: giống từ đĩa petri hoạt hoá được cấy vào môi trường NB trong tủ vô trùng. Lắc các bình giống cấp 1 ở 370C trong 24 giờ, hay để tĩnh trong 48giờ.
Nhân giống cấp 2: giống từ bình giống cấp 1 được chuyển sang bình môi trường NB theo tỷ lệ thích hợp trong tủ vô trùng, đem lắc hay để tĩnh và nuôi trong điều kiện như nuôi giống cấp 1.
Lên men trong bình inox thể tích 10–20lit có sục khí trong 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng.
II.2.1 Các phương pháp thu hồi sinh khối:
• Thu hồi bằng phương pháp ly tâm: Sau khi lên men, sinh khối của các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách đem li tâm dịch lên men với tốc độ 7500 vòng/phút, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp để tạo chế phẩm.
• Thu hồi bằng phương pháp lắng: Sau khi lên men, sinh khối các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách lắng ở 40C trong 24 giờ, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp
II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche
II.3.1 Tạo chế phẩm dạng bột:
Sinh khối các chủng nghiên cứu sau khi thu hồi bằng các phương pháp trên được nuôi trên môi trường xốp có cơ chất là gạo, cám và có bổ sung đường theo công thức đã xác định, nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày. Theo dõi CFU trong 1g chế phẩm trước khi sấy khô. Sau khi lên men xốp, chế phẩm được sấy khô rồi xay thành dạng bột, xác định CFU trong 1 g chế phẩm.
II.3.2 Tạo chế phẩm dạng lỏng:
Sau khi lên men thu hồi sinh khối bằng một trong các phương pháp trên, bổ sung thêm đường, muối theo tỷ lệ thích hợp. Kiểm tra độ tinh khiết và đóng chai. Theo dõi CFU trong 1ml chế phẩm sau hàng tuần.
II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc
Môi trường được sử dụng là môi trường NA.
Các bước tiến hành:
– Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 0,1ml dịch nuôi cấy (nếu là chế phẩm bột thì lấy 1g chế phẩm hoà tan với 5ml nước cất, rồi lấy 0,1ml dịch trong đó) đưa sang ống nghiệm có chứa 0,9ml nước cất. Tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10–1,10–2,10–3,10–4,10–5,10–6...
– Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Môi trường NA, khử trùng ở áp suất 1atm trong 30. Đợi nguội rồi đổ môi trường lên các đĩa petri vô trùng. Chờ thạch đông và hong khô mặt thạch trong tủ vô trùng.
– Cấy và dàn đều dịch pha loãng: dùng pipetman với đầu côn vô trùng lấy 100l dịch ở độ pha loãng cuối cùng và gần cuối cùng nhỏ vào đĩa thạch có môi trường, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần. Dùng que trang thuỷ tinh vô trùng trang đều lên mặt thạch
– Nuôi và đếm khuẩn lạc: các hộp petri đã được cấy dịch tế bào, gói kín và đem nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa, tính trung bình.
– Tính kết quả: số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức sau:
Mục lục
Trang
Lời nói đầu...................................................................................................... 2
Phần I: Tổng quan......................................................................................... 3
I. Vi sinh vật và vai trò của chúng
I.1 Đặc điểm chung của vi sinh vật....................................................... 3
I.2 Dinh dưỡng của vi sinh vật.............................................................. 4
I.3 Yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật.................... 5
I.4 Vai trò của vi sinh vật trong việc bảo vệ môi trường....................... 7
II. Vi khuẩn Bacillus và vai trò phân giải các hợp chất hữu cơ........... 8
II.1 Vi khuẩn Bacillus........................................................................... 8
II.2 Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác động của các
enzim proteaza, amylaza, xelluloza...................................................... 8
III. Vài nét về môi trường nuôi tôm ở nước ta
III.1 Tình hình phát triển nghề nuôi tôm ở nước ta............................... 9
III.2 Đặc điểm và những thông số cơ bản đánh giá môi trường nước
nuôi tôm..................................................................................... 10
III.3 Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước nuôi tôm................. 12
III.4 Yêu cầu về nước nuôi................................................................... 13
III.5 Tình hình xử lý môi trường nước nuôi tôm.................................. 13
IV. Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.................. 14
V. Vi khuẩn Bacillus với chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi tôm.15
Phần II: vật liệu và phương pháp nghiên cứu
I. Vật liệu................................................................................................. 17
I.1 Chủng giống ................................................................................... 17
I.2 Thiết bị............................................................................................ 17
I.3 Hoá chất.......................................................................................... 17
I.4 Môi trường nghiên cứu.................................................................... 18
II. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 19
II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các chủng Bacillus (D2, G1, PA).19
II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối..................................... 20
II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche.................................................. 20
II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc.................................. 20
Phần III: Hướng nghiên cứu........................................................................ 22
Tài liệu tham khảo
Lời mở đầu
Thế giới vi sinh vật xung quanh chúng ta rất đa dạng và phong phú. Sự tồn tại của chúng xác định những vai trò quan trọng không thể thiếu của chúng trong thế giới sinh vật.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, vốn hiểu biết của chúng ta về thế giới nhỏ bé ấy dần được mở rộng. Con người đã biết sử dụng chúng vào những mục đích khác nhau, phục vụ lợi ích của con người. Từ rất lâu, chúng ta đã biết ứng dụng vai trò của vi sinh vật trong các ngành chế biến thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp, y học, môi trường...
Trong những năm qua, nuôi trồng thuỷ sản đã có sự phát triển vượt bậc cả về sản lượng, diện tích, và cả đa dạng về đối tượng nuôi, góp phần chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông thôn, tạo việc làm, tăng thu nhập, cải thiện mức sống cho ngư dân.
Tuy nhiên, ở nước ta, sự phát triển của ngành thuỷ sản vẫn là sự phát triển tự phát, ít có quy hoạch và đặc biệt là vấn đề môi trường nuôi chưa có biện pháp xử lý thường xuyên và thích hợp nên môi trường nước nuôi tôm cá có nguy cơ bị ô nhiễm nghiêm trọng dịch bệnh có cơ hội phát triển. Điều đó ảnh hưởng lớn đến chất lượng và sản lượng tôm cá. Trước đây, để giải quyết tình trạng này, người ta sử dụng hoá chất. Tuy nhiên, ngoài tác dụng mong muốn, các hoá chất còn gây những tác hại ảnh hưởng xấu đến môi trường và cả con người. Cụ thể là lượng chất kháng sinh sử dụng còn tồn dư trong môi trường thuỷ sinh, tích tụ các trong vật nuôi, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm. Đó là rào cản lớn trong việc xuất khẩu thuỷ sản, gây thiệt hại cả về kinh tế và uy tín trên thị trường thế giới.
Hướng tới sự phát triển bền vững đã và đang là chiến lược phát triển kinh tế đúng đắn nhằm tạo ra các sản phẩm sạch và đặc biệt là sản xuất không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc chọn giải pháp thích hợp để xử lý môi trường nước nuôi tôm là hết sức quan trọng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật mang những đặc tính cần thiết để xử lý môi trường nước nuôi tôm, tăng khả năng đề kháng của tôm đang được sử dụng thành công ở nhiều nước trên thế giới. Hiện nay, chế phẩm sinh học đã và đang được nghiên cứu, ứng dụng tại Việt Nam và bước đầu đã có những kết quả khả quan.
Trong đợt thực tập này, tui được nhà trường phân công thực tập tại Viện công nghệ sinh học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Dưới sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Thứ, tui được giao đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm”. Đây là một đề tài có ứng dụng thực tế trong điều kiện nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta.
Phần I:
Tổng Quan
I. Vi sinh vật và vai trò cuả chúng trong việc bảo vệ môi trường
I.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật
Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi.
Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới, chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinhvật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có chung các đặc điểm sau:
I.1.1. Kích thước nhỏ bé.
Vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé, đơn vị để đo kích thước của chungs là micromet, 1m = 10–3 mm. Chính vì kích thước nhỏ bé như vậy nên diện tích bề mặt của một tập đoàn vi sinh vật là rất lớn.
I.1.2. Hấp thụ nhiều, chuyển hoá nhanh.
Mặc dù kích thước nhỏ bé, nhưng vi sinh vật lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao. Chính năng lực chuyển hoá nhanh đó đã đóng vai trò lớn trong hoạt động sống của chúng và có tác động đến cuộc sống của con người.
I.1.3. Sinh trưởng nhanh, phát triển nhanh.
Vì chúng có khả năng thu và chuyển hoá nhanh nên so với những vi sinh vật khác chúng có tốc độ sinh trưởng cũng như sinh sôi nảy nở vô cùng lớn.
I.1.4. Năng lực thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị.
Do khả năng sinh sôi nảy nở nhanh nên khả năng thích ứng của chúng với môi trường cũng nhanh hơn so với những vi sinh vật khác. trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng với những điều kiện sống bất lợi. Người ta nhận thấy lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào vi sinh vật. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên mức sống ở nhiệt độ của N2 lỏng (–1960 C), thậm chí ở nhiệt độ (– 2530 C), một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 2500C, một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 3000C.
Vi sinh vật rất dễ sinh biến dị bởi chúng thường có cấu tạo đơn bào, sinh sản mạnh với số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Tần số biến dị ở vi sinh vật thường là 10–5 –:– 10–10. Hình thức biến dị thường gặp là đột biến gen và dẫn đến những biến đổi về hình thái, cấu tạo, kiểu trao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, kháng thể...
I.1.5. Phân bố rộng, chủng loại nhiều
Vi sinh vật phân bố ở khắp nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong khôngkhí, trên mọi đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, từ nước ngầm đến nước mặt...Trong đường ruột của con người thường có không dưới 100–400 loài vi sinh vật khác nhau, chúng chiếm tới 1/3 khối lượng khô của phân.
Về chủng loại: Trong khi toàn bộ sinh giới động vật có khoảng 1,5 triệu loài, thực vật có khoảng 0,5 triệu loài thì vi sinh vật có tới trên 100 nghìn loài bao gồm 30 nghìn loài động vật nguyên sinh; 69 nghìn loài nấm; 23 nghìn loài vi tảo; 2,5 nghìn loài vi khuẩn lam; 1,5 nghìn loài vi khuẩn; 1,2 nghìn loài virut ...
I.2. Dinh dưỡng vi sinh vật
Vi sinh vật không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng vào tế bào và các sản phẩm của quá trình sống từ tế bào tiết ra môi trường qua toàn thể tế mặt tế bào nhờ quá trình khuếch tán, thẩm thấu và hấp thụ.
I.2.1. Dinh dưỡng cacbon
tuỳ từng trường hợp vào khả năng đồng hoá các nguồn cacbon mà có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm: tự dưỡng và dị dưỡng.
• Vi sinh vật tự dưỡng
Vi sinh vật tự dưỡng có khả năng tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ CO2, H2O và muối khoáng. Dựa vào nguồn năng lượng dùng cho tổng hợp, chúng lại được chia thành các vi sinh vật quang hợp và hoá hợp.
– Các vi sinh vật quang hợp dùng nguồn năng lượng mặt trời, chúng có các màu tựa như diệp lục ở cây xanh. Những vi khuẩn có sắc tố màu đỏ thuộc phân nhóm này.
– Các vi sinh vật hoá hợp dùng nguồn năng lượng được giải phóng trong các phản ứng oxy hoá các chất vô cơ. Vi khuẩn nitơ sử dụng nguồn năng lượng trong phản ứng oxy hoá NH3 để tổng hợp các hợp chất hữu cơ. Những vi khuẩn nitrat, vi khuẩn lưu huỳnh không màu, vi khuẩn sắt thuộc phân nhóm này.
a: số khuẩn lạc có trong hộp petri
b: độ pha loãng.
c: lượng dịch tế bào có trong hộp petri
phần III:
Hướng nghiên cứu:
Hiện nay chế phẩm Bioche đang được đem sử dụng trên thực tế và đã mang lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, quá trình sản xuất ra chế phẩm trong phòng thí nghiệm hiện nay phải qua quá trình lên men có sục khí; nếu xét về mặt ứng dụng thì chưa thật tối ưu về mặt kinh tế. Bởi thế, hướng nghiên cứu đặt ra cho đề tài tốt nghiệp của em là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men chủng Bacillus trong điều kiện tĩnh không có quá trình sục khí bổ sung oxy. Các yếu tố đó là:
+ Thời gian lên men
+ Thành phần môi trường nhân giống
+ Nhiệt độ
+ Điều kiện lên men: sục khí, tĩnh khuấy, tĩnh không khuấy.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm
– Môi trường sản sinh proteaza: môi trường NA có bổ sung 10% sữa.
II Phương pháp nghiên cứu:
II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các loài Bacillus subtilis, Bacillus linchenifomis, Bacillus megaterium (PA, G1, D2).
II.1.1 Đặc điểm hình thái:
• Phương pháp nhuộm gram, soi kính hiển vi: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy 24 – 48h bôi lên phiến kính rồi để khô. Cố định bôi bằng cách hơ phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhuộm bằng dung dịch Crystal violet 1 phút, rửa lại bằng cồn. Tráng nước, làm khô vết bôi và nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fusin loãng trong 1–2 phút. Rửa lại bằng nước, làm khô rồi đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000x. Nừu thấy vi khuẩn màu hồng là vi khuẩn G–, còn nếu là màu tím thì đó là vi khuẩn G+.
II.1.2 Đặc điểm sinh hoá
• khả năng sinh proteaza: Sữa tách béo 10% thanh trùng để riêng. Cờy các chủng Bacillus dưới dạng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường NA có bổ sung 10% sữa đã tách béo, nuôi 24 giờ ở tủ ấm 370C. Quan sát bán kính vòng thủy phân trong suốt xung quanh khuẩn lạc.
• khả năng sinh amylaza: Cờy các chủng từng điểm lên trên các đĩa thạch của môi trường đã có bổ sung 2% tinh bột tan. Sau 1 ngày nuôi trong tủ ấm 370C lấy ra rồi nhỏ dung dịch lugol. Quan sát bán kính vòng thuỷ phân, nếu các chủng có khả năng phân huỷ tinh bột chúng sẽ tạo thành một vòng trong suốt xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển, còn nếu quanh khuẩn lạc mà chỉ toàn màu xanh tím thì vi khuẩn không có khả năng phân huỷ tinh bột.
• Khả năng đối kháng với Vibrio: Đun sôi 2 bình, mỗi bình chứa 15 ml môi trường NA, đổ ra đĩa, để nguội tới 450C. Bổ sung vào bình thứ nhất 110l Vibrio parahaemolytiscus, bình thứ hai 110l Vibrio fuonissii. Cờy chấm điểm các chủng Bacillus trên hai đĩa thạch trên, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chủng nào có khả năng đối kháng sẽ tạo ra vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc của nó. Các chủng thử nghiệm và vi sinh vật gây bệnh đều đã được hoạt hoá trước khi cấy.
• Khả năng chịu mặn: các chủng Bacillus được nuôi trong môi trường NB có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau từ 1 – 10% w/v, nuôi trong điều kiện lắc hay để tĩnh ở 370C trong 1 ngày đêm. Sau đó đếm số khuẩn lạc hay đo mật độ quang OD để đánh giá sị phát triển của các chủng sau thời gian nuôi cấy.
II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối:
Các chủng Bacillus được bảo quản trong các ống efedos, sau đó được hoạt hoá trên môi trường NA trong đĩa petri.
Nhân giống cấp 1: giống từ đĩa petri hoạt hoá được cấy vào môi trường NB trong tủ vô trùng. Lắc các bình giống cấp 1 ở 370C trong 24 giờ, hay để tĩnh trong 48giờ.
Nhân giống cấp 2: giống từ bình giống cấp 1 được chuyển sang bình môi trường NB theo tỷ lệ thích hợp trong tủ vô trùng, đem lắc hay để tĩnh và nuôi trong điều kiện như nuôi giống cấp 1.
Lên men trong bình inox thể tích 10–20lit có sục khí trong 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng.
II.2.1 Các phương pháp thu hồi sinh khối:
• Thu hồi bằng phương pháp ly tâm: Sau khi lên men, sinh khối của các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách đem li tâm dịch lên men với tốc độ 7500 vòng/phút, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp để tạo chế phẩm.
• Thu hồi bằng phương pháp lắng: Sau khi lên men, sinh khối các chủng nuôi cấy được thu hồi bằng cách lắng ở 40C trong 24 giờ, sau đó bổ sung đường, muối theo tỷ lệ thích hợp
II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche
II.3.1 Tạo chế phẩm dạng bột:
Sinh khối các chủng nghiên cứu sau khi thu hồi bằng các phương pháp trên được nuôi trên môi trường xốp có cơ chất là gạo, cám và có bổ sung đường theo công thức đã xác định, nuôi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày. Theo dõi CFU trong 1g chế phẩm trước khi sấy khô. Sau khi lên men xốp, chế phẩm được sấy khô rồi xay thành dạng bột, xác định CFU trong 1 g chế phẩm.
II.3.2 Tạo chế phẩm dạng lỏng:
Sau khi lên men thu hồi sinh khối bằng một trong các phương pháp trên, bổ sung thêm đường, muối theo tỷ lệ thích hợp. Kiểm tra độ tinh khiết và đóng chai. Theo dõi CFU trong 1ml chế phẩm sau hàng tuần.
II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc
Môi trường được sử dụng là môi trường NA.
Các bước tiến hành:
– Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 0,1ml dịch nuôi cấy (nếu là chế phẩm bột thì lấy 1g chế phẩm hoà tan với 5ml nước cất, rồi lấy 0,1ml dịch trong đó) đưa sang ống nghiệm có chứa 0,9ml nước cất. Tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10–1,10–2,10–3,10–4,10–5,10–6...
– Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Môi trường NA, khử trùng ở áp suất 1atm trong 30. Đợi nguội rồi đổ môi trường lên các đĩa petri vô trùng. Chờ thạch đông và hong khô mặt thạch trong tủ vô trùng.
– Cấy và dàn đều dịch pha loãng: dùng pipetman với đầu côn vô trùng lấy 100l dịch ở độ pha loãng cuối cùng và gần cuối cùng nhỏ vào đĩa thạch có môi trường, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần. Dùng que trang thuỷ tinh vô trùng trang đều lên mặt thạch
– Nuôi và đếm khuẩn lạc: các hộp petri đã được cấy dịch tế bào, gói kín và đem nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa, tính trung bình.
– Tính kết quả: số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức sau:
Mục lục
Trang
Lời nói đầu...................................................................................................... 2
Phần I: Tổng quan......................................................................................... 3
I. Vi sinh vật và vai trò của chúng
I.1 Đặc điểm chung của vi sinh vật....................................................... 3
I.2 Dinh dưỡng của vi sinh vật.............................................................. 4
I.3 Yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật.................... 5
I.4 Vai trò của vi sinh vật trong việc bảo vệ môi trường....................... 7
II. Vi khuẩn Bacillus và vai trò phân giải các hợp chất hữu cơ........... 8
II.1 Vi khuẩn Bacillus........................................................................... 8
II.2 Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác động của các
enzim proteaza, amylaza, xelluloza...................................................... 8
III. Vài nét về môi trường nuôi tôm ở nước ta
III.1 Tình hình phát triển nghề nuôi tôm ở nước ta............................... 9
III.2 Đặc điểm và những thông số cơ bản đánh giá môi trường nước
nuôi tôm..................................................................................... 10
III.3 Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước nuôi tôm................. 12
III.4 Yêu cầu về nước nuôi................................................................... 13
III.5 Tình hình xử lý môi trường nước nuôi tôm.................................. 13
IV. Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.................. 14
V. Vi khuẩn Bacillus với chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi tôm.15
Phần II: vật liệu và phương pháp nghiên cứu
I. Vật liệu................................................................................................. 17
I.1 Chủng giống ................................................................................... 17
I.2 Thiết bị............................................................................................ 17
I.3 Hoá chất.......................................................................................... 17
I.4 Môi trường nghiên cứu.................................................................... 18
II. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 19
II.1 Nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các chủng Bacillus (D2, G1, PA).19
II.2 Nhân giống, lên men và thu hồi sinh khối..................................... 20
II.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche.................................................. 20
II.4 Phương pháp xác định đơn vị tạo khuẩn lạc.................................. 20
Phần III: Hướng nghiên cứu........................................................................ 22
Tài liệu tham khảo
Lời mở đầu
Thế giới vi sinh vật xung quanh chúng ta rất đa dạng và phong phú. Sự tồn tại của chúng xác định những vai trò quan trọng không thể thiếu của chúng trong thế giới sinh vật.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, vốn hiểu biết của chúng ta về thế giới nhỏ bé ấy dần được mở rộng. Con người đã biết sử dụng chúng vào những mục đích khác nhau, phục vụ lợi ích của con người. Từ rất lâu, chúng ta đã biết ứng dụng vai trò của vi sinh vật trong các ngành chế biến thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp, y học, môi trường...
Trong những năm qua, nuôi trồng thuỷ sản đã có sự phát triển vượt bậc cả về sản lượng, diện tích, và cả đa dạng về đối tượng nuôi, góp phần chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông thôn, tạo việc làm, tăng thu nhập, cải thiện mức sống cho ngư dân.
Tuy nhiên, ở nước ta, sự phát triển của ngành thuỷ sản vẫn là sự phát triển tự phát, ít có quy hoạch và đặc biệt là vấn đề môi trường nuôi chưa có biện pháp xử lý thường xuyên và thích hợp nên môi trường nước nuôi tôm cá có nguy cơ bị ô nhiễm nghiêm trọng dịch bệnh có cơ hội phát triển. Điều đó ảnh hưởng lớn đến chất lượng và sản lượng tôm cá. Trước đây, để giải quyết tình trạng này, người ta sử dụng hoá chất. Tuy nhiên, ngoài tác dụng mong muốn, các hoá chất còn gây những tác hại ảnh hưởng xấu đến môi trường và cả con người. Cụ thể là lượng chất kháng sinh sử dụng còn tồn dư trong môi trường thuỷ sinh, tích tụ các trong vật nuôi, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm. Đó là rào cản lớn trong việc xuất khẩu thuỷ sản, gây thiệt hại cả về kinh tế và uy tín trên thị trường thế giới.
Hướng tới sự phát triển bền vững đã và đang là chiến lược phát triển kinh tế đúng đắn nhằm tạo ra các sản phẩm sạch và đặc biệt là sản xuất không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc chọn giải pháp thích hợp để xử lý môi trường nước nuôi tôm là hết sức quan trọng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật mang những đặc tính cần thiết để xử lý môi trường nước nuôi tôm, tăng khả năng đề kháng của tôm đang được sử dụng thành công ở nhiều nước trên thế giới. Hiện nay, chế phẩm sinh học đã và đang được nghiên cứu, ứng dụng tại Việt Nam và bước đầu đã có những kết quả khả quan.
Trong đợt thực tập này, tui được nhà trường phân công thực tập tại Viện công nghệ sinh học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Dưới sự hướng dẫn của TS. Võ Thị Thứ, tui được giao đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện đến quá trình lên men tĩnh chủng Bacillus sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi tôm”. Đây là một đề tài có ứng dụng thực tế trong điều kiện nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta.
Phần I:
Tổng Quan
I. Vi sinh vật và vai trò cuả chúng trong việc bảo vệ môi trường
I.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật
Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi.
Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới, chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinhvật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có chung các đặc điểm sau:
I.1.1. Kích thước nhỏ bé.
Vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé, đơn vị để đo kích thước của chungs là micromet, 1m = 10–3 mm. Chính vì kích thước nhỏ bé như vậy nên diện tích bề mặt của một tập đoàn vi sinh vật là rất lớn.
I.1.2. Hấp thụ nhiều, chuyển hoá nhanh.
Mặc dù kích thước nhỏ bé, nhưng vi sinh vật lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao. Chính năng lực chuyển hoá nhanh đó đã đóng vai trò lớn trong hoạt động sống của chúng và có tác động đến cuộc sống của con người.
I.1.3. Sinh trưởng nhanh, phát triển nhanh.
Vì chúng có khả năng thu và chuyển hoá nhanh nên so với những vi sinh vật khác chúng có tốc độ sinh trưởng cũng như sinh sôi nảy nở vô cùng lớn.
I.1.4. Năng lực thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị.
Do khả năng sinh sôi nảy nở nhanh nên khả năng thích ứng của chúng với môi trường cũng nhanh hơn so với những vi sinh vật khác. trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng với những điều kiện sống bất lợi. Người ta nhận thấy lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào vi sinh vật. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên mức sống ở nhiệt độ của N2 lỏng (–1960 C), thậm chí ở nhiệt độ (– 2530 C), một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 2500C, một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 3000C.
Vi sinh vật rất dễ sinh biến dị bởi chúng thường có cấu tạo đơn bào, sinh sản mạnh với số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Tần số biến dị ở vi sinh vật thường là 10–5 –:– 10–10. Hình thức biến dị thường gặp là đột biến gen và dẫn đến những biến đổi về hình thái, cấu tạo, kiểu trao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, kháng thể...
I.1.5. Phân bố rộng, chủng loại nhiều
Vi sinh vật phân bố ở khắp nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong khôngkhí, trên mọi đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, từ nước ngầm đến nước mặt...Trong đường ruột của con người thường có không dưới 100–400 loài vi sinh vật khác nhau, chúng chiếm tới 1/3 khối lượng khô của phân.
Về chủng loại: Trong khi toàn bộ sinh giới động vật có khoảng 1,5 triệu loài, thực vật có khoảng 0,5 triệu loài thì vi sinh vật có tới trên 100 nghìn loài bao gồm 30 nghìn loài động vật nguyên sinh; 69 nghìn loài nấm; 23 nghìn loài vi tảo; 2,5 nghìn loài vi khuẩn lam; 1,5 nghìn loài vi khuẩn; 1,2 nghìn loài virut ...
I.2. Dinh dưỡng vi sinh vật
Vi sinh vật không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng vào tế bào và các sản phẩm của quá trình sống từ tế bào tiết ra môi trường qua toàn thể tế mặt tế bào nhờ quá trình khuếch tán, thẩm thấu và hấp thụ.
I.2.1. Dinh dưỡng cacbon
tuỳ từng trường hợp vào khả năng đồng hoá các nguồn cacbon mà có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm: tự dưỡng và dị dưỡng.
• Vi sinh vật tự dưỡng
Vi sinh vật tự dưỡng có khả năng tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ CO2, H2O và muối khoáng. Dựa vào nguồn năng lượng dùng cho tổng hợp, chúng lại được chia thành các vi sinh vật quang hợp và hoá hợp.
– Các vi sinh vật quang hợp dùng nguồn năng lượng mặt trời, chúng có các màu tựa như diệp lục ở cây xanh. Những vi khuẩn có sắc tố màu đỏ thuộc phân nhóm này.
– Các vi sinh vật hoá hợp dùng nguồn năng lượng được giải phóng trong các phản ứng oxy hoá các chất vô cơ. Vi khuẩn nitơ sử dụng nguồn năng lượng trong phản ứng oxy hoá NH3 để tổng hợp các hợp chất hữu cơ. Những vi khuẩn nitrat, vi khuẩn lưu huỳnh không màu, vi khuẩn sắt thuộc phân nhóm này.
a: số khuẩn lạc có trong hộp petri
b: độ pha loãng.
c: lượng dịch tế bào có trong hộp petri
phần III:
Hướng nghiên cứu:
Hiện nay chế phẩm Bioche đang được đem sử dụng trên thực tế và đã mang lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, quá trình sản xuất ra chế phẩm trong phòng thí nghiệm hiện nay phải qua quá trình lên men có sục khí; nếu xét về mặt ứng dụng thì chưa thật tối ưu về mặt kinh tế. Bởi thế, hướng nghiên cứu đặt ra cho đề tài tốt nghiệp của em là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men chủng Bacillus trong điều kiện tĩnh không có quá trình sục khí bổ sung oxy. Các yếu tố đó là:
+ Thời gian lên men
+ Thành phần môi trường nhân giống
+ Nhiệt độ
+ Điều kiện lên men: sục khí, tĩnh khuấy, tĩnh không khuấy.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator:
