than_hanh2011
New Member
Link tải luận án tiến sỹ sinh học cho anh em
Trang
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................vi
DANH MỤC HÌNH.................................................................................. viii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................xi
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................5
1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể ............................................................5
1.2. Bệnh tiểu đường ...................................................................................8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin ......................................................10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật..........................................................10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA ................................12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli ..................................18
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp...............................18
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp ...............20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli .......................................24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST ................................24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis ................................25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL.........................27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP ...........................27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật ........................................................28
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp................................28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .................................................................................29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục ..........................................................................32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung ...................................................................32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất
protein tái tổ hợp .........................................................................................34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có
hoạt tính ..............................................................................................39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .....................................39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp......................................................40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính ...........................43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp.............44
1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất
insulin từ mini-proinsulin.............................................................................45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin.....47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP.........................................49
2.1. công cụ và thiết bị .............................................................................49
2.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .................................................49
2.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh ..............................................49
2.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein ..............................................................49
2.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết..........................................50
2.2. Hóa chất và môi trường ......................................................................50
2.2.1. Hóa chất ......................................................................................................50
2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh.........................................................................55
2.3. Nguyên vật liệu ..................................................................................55
2.3.1. Chủng vi sinh vật.........................................................................................55
2.3.2. Plasmid ........................................................................................................56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự ................................56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .....................................................57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA..................................57
2.4. Phương pháp .......................................................................................58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương
pháp PCR tái tổ hợp ....................................................................................58
2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns)..........................................61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a...............................62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI ...................63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ......................................................................66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins
được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB................................................68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng
phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm................................69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy
mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L ...................................................................70
2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào.......................................71
2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI .........................................72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA............72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI ..................72
2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .............73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại.............................75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận
insulin có hoạt tính ......................................................................................75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA ...........76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .....................................77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .....................................77
2.4.21. Phương pháp định lượng protein...............................................................77
2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp......................79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN................................................80
3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung
hợp với 6xHis (6xHis-MPI).................................................................80
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli.............80
3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue........................................................81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp 6xHis-MPI ............................................................................................83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI ..............................................87
3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp
ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot ........................................89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................................89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................91
3.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/
pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm.........................................................95
3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo cách mẻ- bổ sung ở qui
mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI...............................................................101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên..................................................104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI ............................................................104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi.................................................................105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .....................................................................107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI ...................................................................111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI ......................................................................................111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin.................................................................116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .........................118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot ................119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ...........................................................................122
-1-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%
dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1].
Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã
hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh,
nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí lớn về kinh tế có
thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật
gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ
lớp trẻ [1].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn
tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số
người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành
nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1].
Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hay do cơ thể người bệnh
kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β
của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương -2-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do
số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở
châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo
ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007
lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ
kim [41].
Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu
hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản
xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên
thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với
nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay
thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide
và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là
bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng
hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định
sự thành công của công nghệ do cần biến đổi các codon thích hợp để tăng
cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu
nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng
thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần biến tính để làm tan, sau đó tiến
hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn
được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu
insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, -3-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2
chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các
chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu
nhận insulin có hoạt tính.
Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn
insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn
kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời
cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày
với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam
cần nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg
insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin
tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển
trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui
trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần
giải quyết khó khăn trên.
Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã
hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công
nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình
công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công
nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu
đặt ra.
Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số -4-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong
nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui
trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide
trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên
men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa
thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công
nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh
tiểu đường.
Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái
tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện
mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng
E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin
có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm vào Link, đợi vài giây sau đó bấm Get Website để tải:
Trang
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................vi
DANH MỤC HÌNH.................................................................................. viii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................xi
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................5
1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể ............................................................5
1.2. Bệnh tiểu đường ...................................................................................8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin ......................................................10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật..........................................................10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA ................................12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli ..................................18
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp...............................18
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp ...............20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli .......................................24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST ................................24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis ................................25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL.........................27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP ...........................27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật ........................................................28
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp................................28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .................................................................................29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục ..........................................................................32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung ...................................................................32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất
protein tái tổ hợp .........................................................................................34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có
hoạt tính ..............................................................................................39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .....................................39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp......................................................40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính ...........................43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp.............44
1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất
insulin từ mini-proinsulin.............................................................................45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin.....47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP.........................................49
2.1. công cụ và thiết bị .............................................................................49
2.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .................................................49
2.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh ..............................................49
2.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein ..............................................................49
2.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết..........................................50
2.2. Hóa chất và môi trường ......................................................................50
2.2.1. Hóa chất ......................................................................................................50
2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh.........................................................................55
2.3. Nguyên vật liệu ..................................................................................55
2.3.1. Chủng vi sinh vật.........................................................................................55
2.3.2. Plasmid ........................................................................................................56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự ................................56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .....................................................57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA..................................57
2.4. Phương pháp .......................................................................................58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương
pháp PCR tái tổ hợp ....................................................................................58
2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns)..........................................61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a...............................62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI ...................63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ......................................................................66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins
được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB................................................68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng
phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm................................69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy
mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L ...................................................................70
2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào.......................................71
2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI .........................................72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA............72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI ..................72
2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .............73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại.............................75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận
insulin có hoạt tính ......................................................................................75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA ...........76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .....................................77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .....................................77
2.4.21. Phương pháp định lượng protein...............................................................77
2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp......................79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN................................................80
3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung
hợp với 6xHis (6xHis-MPI).................................................................80
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli.............80
3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue........................................................81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp 6xHis-MPI ............................................................................................83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI ..............................................87
3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp
ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot ........................................89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................................89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................91
3.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/
pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm.........................................................95
3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo cách mẻ- bổ sung ở qui
mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI...............................................................101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên..................................................104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI ............................................................104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi.................................................................105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .....................................................................107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI ...................................................................111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI ......................................................................................111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin.................................................................116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .........................118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot ................119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ...........................................................................122
-1-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%
dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1].
Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã
hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh,
nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí lớn về kinh tế có
thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật
gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ
lớp trẻ [1].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn
tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số
người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành
nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1].
Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hay do cơ thể người bệnh
kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β
của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương -2-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do
số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở
châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo
ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007
lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ
kim [41].
Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu
hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản
xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên
thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với
nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay
thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide
và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là
bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng
hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định
sự thành công của công nghệ do cần biến đổi các codon thích hợp để tăng
cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu
nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng
thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần biến tính để làm tan, sau đó tiến
hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn
được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu
insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, -3-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2
chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các
chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu
nhận insulin có hoạt tính.
Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn
insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn
kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời
cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày
với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam
cần nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg
insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin
tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển
trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui
trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần
giải quyết khó khăn trên.
Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã
hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công
nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình
công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công
nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu
đặt ra.
Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số -4-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong
nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui
trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide
trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên
men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa
thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công
nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh
tiểu đường.
Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái
tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện
mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng
E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin
có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm vào Link, đợi vài giây sau đó bấm Get Website để tải:
You must be registered for see links