Download Đề tài Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng kỹ thuật rt - Pcr để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
TÓM TẮT
NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đề tài:
“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày
10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Hội đồng hướng dẫn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải
PGS.TS. Trần Thị Dân
Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng sử dụng quy trình RT-PCR để phát
hiện virus gây bệnh PRRS trên lợn. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Xây dựng quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS
đồng thời kiểm tra khả năng của ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start của
công ty Promega, Taq polymerase của công ty Biorad, Taq polymersa của công ty
ABgene).
- Ly trích RNA trên các mẫu phổi bằng quy trình dùng TRIzol và điện di RNA
tổng số nhằm kiểm tra khả năng sử dụng quy trình này trong việc ly trích RNA của
virus.
- Ly trích RNA từ các mẫu huyết thanh và dịch nuôi cấy tế bào từ những lợn
nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết quả ELISA. Sau đó thực hiện phản ứng
RT-PCR để kiểm tra sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong các mẫu này.
Kết quả, đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện RNA chuẩn của
virus gây bệnh PRRS và đã áp dụng thành công trong việc sử dụng TRIzol để ly trích
RNA. Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ các mẫu thu nhận bằng cả hai
quy trình sử dụng bộ kit và sử dụng TRIzol, kết quả thu nhận là tất cả các mẫu xét
nghiệm đều không có sự hiện diện của virus tại thời điểm xét nghiệm.
ii
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỤC LỤC
Tên mục Trang
LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT................................................................................................................. iv
MỤC LỤC .................................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ ix
Phần I: MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục đích và yêu cầu........................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu................................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử bệnh.............................................................................................. 3
2.1.3 Dịch tễ học ................................................................................................ 4
2.1.4 Các con đường lây nhiễm ......................................................................... 5
2.1.4.1 Sự lây truyền dọc................................................................................. 5
2.1.4.2 Sự lây truyền ngang............................................................................. 6
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng................................................................................ 7
2.1.6 Bệnh tích ................................................................................................... 8
2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra ............. 8
2.2.1. Phân lập virus sống ................................................................................... 8
2.2.2. Phân lập virus hay kháng nguyên virus................................................... 9
2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh.............................. 10
2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS ................... 12
2.3. Phương pháp PCR.......................................................................................... 13
2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 13
2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR ................................................ 13
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR .............................................................. 14
2.3.4. Thiết bị và công cụ cho phản ứng PCR .................................................. 15
iii2.4 Phương pháp RT-PCR ................................................................................... 16
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR......................................................... 16
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược.............................................. 16
2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược .......................................................... 18
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP..................................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................. 20
3.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 20
3.3. Vật liệu và hóa chất........................................................................................ 20
3.3.1. Mẫu xét nghiệm ...................................................................................... 20
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 20
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA................................................ 21
3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA .................................................... 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR........................................................... 21
3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR............................... 22
3.4. Thiết bị và dụng cụ......................................................................................... 22
3.5. Các phương pháp ........................................................................................... 22
3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào ................................................................ 22
3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh .................................................... 23
3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình
sử dụng TRIzol................................................................................................... 23
3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính.......................................... 24
3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus................................................... 25
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR...................................................................... 27
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 28
4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV .............................................. 28
4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega).............................................. 28
4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene ............................ 29
4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích ....................................................... 30
4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng
phương pháp sử dụng TRIzol .............................................................................. 30
4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích
từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit ............................ 31
iv
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích........................................................................ 32
4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer........................................................ 33
4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 .............................................................. 33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................... 35
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị........................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. x
vDANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
- AMV: Avian myeloblastosis virus
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EAV: Equine arteritis virus
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- FAb: Fluorescent antibody
- FA: Formaldehyde agarose
- IHC: Immunohistochemistry staining
- IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay
- LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus
- MDS: Mystery swine disease
- MOPS: 3- morpholine propane sulphonate
- ORF: Open reading fraction
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus
- RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus
- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- TE: Tris EDTA
- μl: Micro lit
vi
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiDANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Tên mục Trang
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược ........................ 19
Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng.............................................................. 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR ..................................................................... 25
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR............................................................. 26
Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28
Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công
ty Biorad và Abgene. ...................................................................................................... 29
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
TRIzol.............................................................................................................................. 30
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
bộ kit................................................................................................................................ 31
Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích................................................................ 32
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5
mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol ................................................... 34
viiPhần I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân
chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây
sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hay lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện
ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và
những khó khăn về hô hấp ở lợn.
Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung
hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân
lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hay kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc
bệnh và qui mô đàn lớn.
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán
và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp
nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian.
Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách
mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được
ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian
và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.
Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn
đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị
Dân, chúng tui thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”.
1
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1.2. Mục tiêu – yêu cầu
Mục tiêu
Thăm dò khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase
polymerase chain reaction) trong chẩn đoán virus PRRS.
Yêu cầu
- Thiết lập quy trình phát hiện sự hiện diện RNA của virus PRRS trong mẫu
RNA chuẩn.
- Ly trích RNA và điện di RNA từ một số mẫu bệnh phẩm.
- Sử dụng quy trình RT - PCR vừa thiết lập để kiểm tra sự hiện diện RNA virus
trong huyết thanh và trong dịch nuôi cấy tế bào.
2Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
2.1.1. Giới thiệu
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome) là bệnh gây ra bởi virus thuộc nhóm Arteriviridae có khả
năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Đặc biệt, bệnh có một lịch sử dịch tễ học
phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện thông thường trong chăn nuôi
lợn công nghiệp. Đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong
nền công nghiệp nuôi lợn trên thế giới
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều
tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”(2).
Đầu tiên, trên cơ sở về hình thái học, tổ chức gene, sự sao chép, dịch mã và vị
trí protein giống nhau, PRRSV đã được định danh cùng nhóm với virus gây viêm động
mạch ở ngựa (EAV: equine arteritis virus), virus LDV (lactate dehydrogenase
elevating virus) và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV: simian hemorrhagic fewer
virus). Những họ virus này có khả năng sao chép trong đại thực bào và nhiễm bệnh lâu
dài trên vật chủ tự nhiên của chúng (dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 7).
Nhìn chung, PRRS có những biểu hiện lâm sàng giống nhau giữa dòng Châu
Mỹ và dòng Châu Âu. Tuy nhiên, những dòng này có những đặc tính gây bệnh, kiểu
kháng nguyên và những đặc tính di truyền khác nhau. Những đặc điểm khác nhau này
là cơ sở cho việc phân loại các dòng thành hai nhóm nhỏ: nhóm A gồm hầu hết các
dòng ở Nam Mỹ và nhóm B gồm hầu hết các dòng ở Châu Âu (19).
2.1.2. Lịch sử bệnh (11)
Vào cuối thập niên 80 đã xảy ra một trận đại dịch ở Mỹ. Người ta mô tả đầu
tiên về một hội chứng bệnh ở vùng phía nam Carolina, bao gồm việc suy giảm mạnh
khả năng sinh sản, viêm phổi sau cai sữa, gia tăng tỉ lệ tử vong ở heo. Nguyên nhân
lúc bấy giờ chưa được biết, do đó được gọi với tên gọi “bệnh thần bí ở lợn” (MSD:
mystery swine disease).
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiĐầu tiên có rất nhiều ý kiến về nguyên nhân gây ra trận đại dịch, bao gồm,
nguyên nhân do virus viêm não và cơ tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus,
porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus,… và cả nguyên nhân do
thức ăn bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxins). Ở Canada, một dạng virus gây bệnh cúm
type A được phân lập ở heo con bệnh về hô hấp và cũng được đưa vào danh sách nghi
ngờ nguyên nhân gây ra “bệnh thần bí”. Việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ngày
càng khó khăn bởi vì nhiều tác nhân gây bệnh được phân lập từ “bệnh thần bí”. Ở Châu
Âu, một trận dịch tương tự như MSD cũng được báo cáo ở vùng Münster của Đức
(1992), bệnh này lập tức lan ra một cách nhanh chóng và có đến khoảng 3000 trận dịch
đã xảy ra ở Đức cho đến tháng 5 năm 1991. Không tìm thấy sự liên quan nào giữa trận
dịch ở Đức và ở Mỹ (Anoon, 1991). Căn bệnh này cũng được báo cáo ở Netherlands
vào tháng 1 năm 1991 và ở Belgium vào tháng 3 năm 1991 (OIE, 1992). Trường hợp
đầu tiên của bệnh phát hiện ở Tây Ban Nha là qua biểu hiện lâm sàng của đàn heo sống
nhập khẩu. Ba trận dịch được báo cáo ở Tây Ban Nha, trong đó hai trường hợp xảy ra ở
tỉnh Huesca và một trường hợp xảy ra ở tỉnh Lerida, tất cả các heo ở đây đều bị giết thịt
nhanh chóng. Ở Anh, “bệnh tai xanh” (một dạng biểu hiện lâm sàng của bệnh PRRS)
xuất hiện vào tháng 5 năm 1991 . Điều đáng chú ý là ở Anh tại thời điểm này không có
hiện tượng nhập khẩu heo sống, tinh trùng hay phôi từ những quốc gia đang có bệnh
MDS trong vòng 12 tháng; vì vậy không có sự giải thích rõ ràng về nguồn gốc gây ra
căn bệnh này ở Anh. Ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở Brittany vào tháng 10
năm 1991, sau đó là trận dịch ở Đan Mạch vào tháng 3 năm 1992.
Ở châu Á, trận dịch đầu tiên xuất hiện ở Nhật năm 1988 và Đài Loan vào năm
1991. Như vậy, đại dịch MSD đã lan truyền trên hầu hết các trung tâm chăn nuôi lợn
lớn trên thế giới chỉ trong khoảng thời gian vài năm.
Bệnh này trước đây được gọi với nhiều tên khác nhau. Cho đến năm 1992, tổ
chức dịch tể thế giới (OIE) và hội nghị quốc tế về bệnh này ở St.Paul, Minnestota đã
nhất trí sử dụng tên PRRS để chỉ loại bệnh này.
2.1.3. Dịch tễ học
Bệnh PRRS nổi lên trong ngành chăn nuôi lợn ở Bắc Mỹ và Châu Âu từ những
năm 1987. Bệnh này cũng gặp ở Mỹ, Hà Lan, Pháp, Canada, Đức và Anh. Điều tra
huyết thanh học ở đàn lợn nái có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS cho
4thấy rằng 75 % bệnh có phản ứng dương tính với virus Lelystad, gần 10 % có dương
tính với các virus khác như Encephalomyocarditis(2).
Ở Châu Âu, bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào tháng 11/1991, ở Hà
Lan vào tháng 1/1991. Bệnh này nhanh chóng lây lan theo hướng tây nam và sau đó
chuyển sang hướng bắc theo hướng gió thổi. Việc lan truyền theo đường không khí cũng
được đề cập đến vì ngay cả những đàn được chăm sóc và cách ly tốt với đàn bị bệnh
cũng bị nhiễm bệnh.
Việc lây lan bệnh liên quan tới việc vận chuyển lợn cái hậu bị từ các đàn giống
riêng lẻ tới các trại giống khác. Mở rộng điều tra không phát hiện được bệnh lúc đầu
được đưa vào Anh như thế nào. Việc áp dụng luật hạn chế vận chuyển lợn từ đàn bị
bệnh đã làm chậm tốc độ lây lan bệnh nhưng việc lây lan bệnh vẫn xảy ra thường xuyên
ở khoảng cách vài km trong những vùng có mật độ gia súc lớn.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên bằng các phản ứng huyết thanh
học vào năm 1997, trên đàn lợn nhập từ Mỹ phát hiện có 10 con bị bệnh trong tổng số
51 con. Trong báo cáo của Trung tâm thú y vùng TP.Hồ Chí Minh đã điều tra huyết
thanh học ở 17 trại chăn nuôi lợn thuộc các tỉnh Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tiền Giang và
Vĩnh Long kết quả cho thấy 6 trại giống có huyết thanh dương tính, 596 trong tổng số
3402 con xét nghiệm có phản ứng dương tính. Tỉ lệ dương tính ở mỗi trại là từ 1,3 %
đến 68,29 % (2).
Bệnh ảnh hưởng tới lợn nái, lợn chửa và lợn con theo mẹ, lợn mới cai sữa, lợn
đang lớn và lợn thịt ở giai đoạn cuối.
2.1.4. Các con đƣờng lây nhiễm
Sự lan truyền tác nhân gây bệnh xảy ra khi tác nhân gây bệnh được thoát ra khỏi
vật chủ, giải phóng ra môi trường bên ngoài, vượt qua được hàng rào phòng thủ của vật
chủ và tiếp cận đến vị trí sao chép trong một vật chủ mới và nhạy cảm. Sự lan truyền
của virus PRRS thông qua nhiều con đường khác nhau (4).
2.1.4.1. Sự lây truyền dọc
Sự lan truyền của virus PRRS qua nhau thai được báo cáo đầu tiên bởi
Christianson và cộng sự (1992). Cho đến ngày nay, đã có những chứng cứ chắc chắn
rằng virus xuất hiện ở tháng thứ ba trong quá trình mang thai. Tuy nhiên, Molitor và
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phicộng sự (2001) khám phá ra rằng trong một vài trường hợp virus có thể phân lập vào
ngày thứ 30 trong thời kỳ mang thai (4).
Virus PRRS còn có thể lây truyền thông qua quá trình thụ tinh. Prieto và cộng
sự (1996) phát hiện ra rằng khi thụ tinh bằng tinh dịch bị nhiễm virus PRRS Tây Ban
Nha dòng 5710 không ảnh hưởng đến sự thụ thai, nhưng virus lại phát hiện trong phôi
20 ngày tuổi (4).
2.1.4.2. Sự lây truyền ngang
Sự truyền lây trực tiếp
Sự truyền lây virus PRRS thường xuyên xảy ra thông qua con đường truyền lây
trực tiếp. Chẳng hạn như sự truyền lây thông qua sự tương tác gần giữa các con thú
hay thông qua các dịch bị lây nhiễm (tinh dịch, máu ngay cả từ sữa). Việc chăn nuôi
theo bầy và tập tính hay tấn công nhau là một nguyên nhân rất quan trọng dẩn đến sự
truyền lây trực tiếp (11).
Sự truyền lây gián tiếp (4)
Sự truyền lây gián tiếp là sự truyền lây thông qua một vật mang tác nhân lây nhiễm.
Các vật mang ở đây có thể là kiến, loài chân đốt (arthropods) và khí dung (aerosol).
Theo những nghiên cứu trước đây, PRRS rất dễ bị bất hoạt khi bị bài thải ra
môi trường xung quanh. Theo nghiên cứu của Pirtle và Beran (1996) trong điều kiện
ấm và khô virus PRRS sẽ bị bất hoạt rất nhanh. Otake và cộng sự trong một nghiên
cứu năm 2002 cho rằng virus PRRS có thể tồn tại trên trang phục của công nhân trong
thời gian khoảng 60 phút sau khi người công nhân tiếp xúc với heo bị nhiễm bệnh. Sự
lây nhiễm máu trên các công cụ y tế cũng là tác nhân truyền bệnh.
Côn trùng (9)
Côn trùng là một tác nhân lây truyền bệnh rất nguy hiểm. Côn trùng được xem
là một vật mang cơ học, thể hiện ở chổ tác nhân gây bệnh thông qua côn trùng có thể
được mang đi khắp nơi. Côn trùng còn được xem là một vật mang sinh học, thể hiện ở
chổ các tác nhân gây bệnh có thể sao chép để nhân lên trong vật mang trước khi lây
truyền cho vật chủ.
Vai trò của côn trùng trong việc truyền lây virus PRRS là một lĩnh vực được
nghiên cứu thường xuyên. Năm 2002, Otake và cộng sự đã có báo cáo về việc phát
hiện virus PRRS trên lớp vỏ của một loài chân khớp sau khi có trận bùng phát bệnMỤC LỤC
Tên mục Trang
LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT................................................................................................................. iv
MỤC LỤC .................................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ ix
Phần I: MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục đích và yêu cầu........................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu................................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử bệnh.............................................................................................. 3
2.1.3 Dịch tễ học ................................................................................................ 4
2.1.4 Các con đường lây nhiễm ......................................................................... 5
2.1.4.1 Sự lây truyền dọc................................................................................. 5
2.1.4.2 Sự lây truyền ngang............................................................................. 6
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng................................................................................ 7
2.1.6 Bệnh tích ................................................................................................... 8
2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra ............. 8
2.2.1. Phân lập virus sống ................................................................................... 8
2.2.2. Phân lập virus hay kháng nguyên virus................................................... 9
2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh.............................. 10
2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS ................... 12
2.3. Phương pháp PCR.......................................................................................... 13
2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 13
2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR ................................................ 13
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR .............................................................. 14
2.3.4. Thiết bị và công cụ cho phản ứng PCR .................................................. 15
iii2.4 Phương pháp RT-PCR ................................................................................... 16
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR......................................................... 16
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược.............................................. 16
2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược .......................................................... 18
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP..................................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................. 20
3.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 20
3.3. Vật liệu và hóa chất........................................................................................ 20
3.3.1. Mẫu xét nghiệm ...................................................................................... 20
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 20
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA................................................ 21
3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA .................................................... 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR........................................................... 21
3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR............................... 22
3.4. Thiết bị và dụng cụ......................................................................................... 22
3.5. Các phương pháp ........................................................................................... 22
3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào ................................................................ 22
3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh .................................................... 23
3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình
sử dụng TRIzol................................................................................................... 23
3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính.......................................... 24
3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus................................................... 25
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR...................................................................... 27
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 28
4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV .............................................. 28
4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega).............................................. 28
4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene ............................ 29
4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích ....................................................... 30
4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng
phương pháp sử dụng TRIzol .............................................................................. 30
4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích
từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit ............................ 31
iv
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích........................................................................ 32
4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer........................................................ 33
4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 .............................................................. 33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................... 35
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị........................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. x
vDANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
- AMV: Avian myeloblastosis virus
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EAV: Equine arteritis virus
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- FAb: Fluorescent antibody
- FA: Formaldehyde agarose
- IHC: Immunohistochemistry staining
- IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay
- LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus
- MDS: Mystery swine disease
- MOPS: 3- morpholine propane sulphonate
- ORF: Open reading fraction
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus
- RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus
- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- TE: Tris EDTA
- μl: Micro lit
vi
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiDANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Tên mục Trang
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược ........................ 19
Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng.............................................................. 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR ..................................................................... 25
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR............................................................. 26
Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28
Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công
ty Biorad và Abgene. ...................................................................................................... 29
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
TRIzol.............................................................................................................................. 30
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
bộ kit................................................................................................................................ 31
Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích................................................................ 32
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5
mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol ................................................... 34
viiPhần I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân
chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây
sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hay lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện
ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và
những khó khăn về hô hấp ở lợn.
Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung
hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân
lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hay kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc
bệnh và qui mô đàn lớn.
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán
và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp
nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian.
Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách
mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được
ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian
và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.
Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn
đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị
Dân, chúng tui thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”.
1
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1.2. Mục tiêu – yêu cầu
Mục tiêu
Thăm dò khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase
polymerase chain reaction) trong chẩn đoán virus PRRS.
Yêu cầu
- Thiết lập quy trình phát hiện sự hiện diện RNA của virus PRRS trong mẫu
RNA chuẩn.
- Ly trích RNA và điện di RNA từ một số mẫu bệnh phẩm.
- Sử dụng quy trình RT - PCR vừa thiết lập để kiểm tra sự hiện diện RNA virus
trong huyết thanh và trong dịch nuôi cấy tế bào.
2Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
2.1.1. Giới thiệu
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome) là bệnh gây ra bởi virus thuộc nhóm Arteriviridae có khả
năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Đặc biệt, bệnh có một lịch sử dịch tễ học
phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện thông thường trong chăn nuôi
lợn công nghiệp. Đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong
nền công nghiệp nuôi lợn trên thế giới
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều
tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”(2).
Đầu tiên, trên cơ sở về hình thái học, tổ chức gene, sự sao chép, dịch mã và vị
trí protein giống nhau, PRRSV đã được định danh cùng nhóm với virus gây viêm động
mạch ở ngựa (EAV: equine arteritis virus), virus LDV (lactate dehydrogenase
elevating virus) và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV: simian hemorrhagic fewer
virus). Những họ virus này có khả năng sao chép trong đại thực bào và nhiễm bệnh lâu
dài trên vật chủ tự nhiên của chúng (dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 7).
Nhìn chung, PRRS có những biểu hiện lâm sàng giống nhau giữa dòng Châu
Mỹ và dòng Châu Âu. Tuy nhiên, những dòng này có những đặc tính gây bệnh, kiểu
kháng nguyên và những đặc tính di truyền khác nhau. Những đặc điểm khác nhau này
là cơ sở cho việc phân loại các dòng thành hai nhóm nhỏ: nhóm A gồm hầu hết các
dòng ở Nam Mỹ và nhóm B gồm hầu hết các dòng ở Châu Âu (19).
2.1.2. Lịch sử bệnh (11)
Vào cuối thập niên 80 đã xảy ra một trận đại dịch ở Mỹ. Người ta mô tả đầu
tiên về một hội chứng bệnh ở vùng phía nam Carolina, bao gồm việc suy giảm mạnh
khả năng sinh sản, viêm phổi sau cai sữa, gia tăng tỉ lệ tử vong ở heo. Nguyên nhân
lúc bấy giờ chưa được biết, do đó được gọi với tên gọi “bệnh thần bí ở lợn” (MSD:
mystery swine disease).
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiĐầu tiên có rất nhiều ý kiến về nguyên nhân gây ra trận đại dịch, bao gồm,
nguyên nhân do virus viêm não và cơ tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus,
porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus,… và cả nguyên nhân do
thức ăn bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxins). Ở Canada, một dạng virus gây bệnh cúm
type A được phân lập ở heo con bệnh về hô hấp và cũng được đưa vào danh sách nghi
ngờ nguyên nhân gây ra “bệnh thần bí”. Việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ngày
càng khó khăn bởi vì nhiều tác nhân gây bệnh được phân lập từ “bệnh thần bí”. Ở Châu
Âu, một trận dịch tương tự như MSD cũng được báo cáo ở vùng Münster của Đức
(1992), bệnh này lập tức lan ra một cách nhanh chóng và có đến khoảng 3000 trận dịch
đã xảy ra ở Đức cho đến tháng 5 năm 1991. Không tìm thấy sự liên quan nào giữa trận
dịch ở Đức và ở Mỹ (Anoon, 1991). Căn bệnh này cũng được báo cáo ở Netherlands
vào tháng 1 năm 1991 và ở Belgium vào tháng 3 năm 1991 (OIE, 1992). Trường hợp
đầu tiên của bệnh phát hiện ở Tây Ban Nha là qua biểu hiện lâm sàng của đàn heo sống
nhập khẩu. Ba trận dịch được báo cáo ở Tây Ban Nha, trong đó hai trường hợp xảy ra ở
tỉnh Huesca và một trường hợp xảy ra ở tỉnh Lerida, tất cả các heo ở đây đều bị giết thịt
nhanh chóng. Ở Anh, “bệnh tai xanh” (một dạng biểu hiện lâm sàng của bệnh PRRS)
xuất hiện vào tháng 5 năm 1991 . Điều đáng chú ý là ở Anh tại thời điểm này không có
hiện tượng nhập khẩu heo sống, tinh trùng hay phôi từ những quốc gia đang có bệnh
MDS trong vòng 12 tháng; vì vậy không có sự giải thích rõ ràng về nguồn gốc gây ra
căn bệnh này ở Anh. Ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở Brittany vào tháng 10
năm 1991, sau đó là trận dịch ở Đan Mạch vào tháng 3 năm 1992.
Ở châu Á, trận dịch đầu tiên xuất hiện ở Nhật năm 1988 và Đài Loan vào năm
1991. Như vậy, đại dịch MSD đã lan truyền trên hầu hết các trung tâm chăn nuôi lợn
lớn trên thế giới chỉ trong khoảng thời gian vài năm.
Bệnh này trước đây được gọi với nhiều tên khác nhau. Cho đến năm 1992, tổ
chức dịch tể thế giới (OIE) và hội nghị quốc tế về bệnh này ở St.Paul, Minnestota đã
nhất trí sử dụng tên PRRS để chỉ loại bệnh này.
2.1.3. Dịch tễ học
Bệnh PRRS nổi lên trong ngành chăn nuôi lợn ở Bắc Mỹ và Châu Âu từ những
năm 1987. Bệnh này cũng gặp ở Mỹ, Hà Lan, Pháp, Canada, Đức và Anh. Điều tra
huyết thanh học ở đàn lợn nái có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS cho
4thấy rằng 75 % bệnh có phản ứng dương tính với virus Lelystad, gần 10 % có dương
tính với các virus khác như Encephalomyocarditis(2).
Ở Châu Âu, bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào tháng 11/1991, ở Hà
Lan vào tháng 1/1991. Bệnh này nhanh chóng lây lan theo hướng tây nam và sau đó
chuyển sang hướng bắc theo hướng gió thổi. Việc lan truyền theo đường không khí cũng
được đề cập đến vì ngay cả những đàn được chăm sóc và cách ly tốt với đàn bị bệnh
cũng bị nhiễm bệnh.
Việc lây lan bệnh liên quan tới việc vận chuyển lợn cái hậu bị từ các đàn giống
riêng lẻ tới các trại giống khác. Mở rộng điều tra không phát hiện được bệnh lúc đầu
được đưa vào Anh như thế nào. Việc áp dụng luật hạn chế vận chuyển lợn từ đàn bị
bệnh đã làm chậm tốc độ lây lan bệnh nhưng việc lây lan bệnh vẫn xảy ra thường xuyên
ở khoảng cách vài km trong những vùng có mật độ gia súc lớn.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên bằng các phản ứng huyết thanh
học vào năm 1997, trên đàn lợn nhập từ Mỹ phát hiện có 10 con bị bệnh trong tổng số
51 con. Trong báo cáo của Trung tâm thú y vùng TP.Hồ Chí Minh đã điều tra huyết
thanh học ở 17 trại chăn nuôi lợn thuộc các tỉnh Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tiền Giang và
Vĩnh Long kết quả cho thấy 6 trại giống có huyết thanh dương tính, 596 trong tổng số
3402 con xét nghiệm có phản ứng dương tính. Tỉ lệ dương tính ở mỗi trại là từ 1,3 %
đến 68,29 % (2).
Bệnh ảnh hưởng tới lợn nái, lợn chửa và lợn con theo mẹ, lợn mới cai sữa, lợn
đang lớn và lợn thịt ở giai đoạn cuối.
2.1.4. Các con đƣờng lây nhiễm
Sự lan truyền tác nhân gây bệnh xảy ra khi tác nhân gây bệnh được thoát ra khỏi
vật chủ, giải phóng ra môi trường bên ngoài, vượt qua được hàng rào phòng thủ của vật
chủ và tiếp cận đến vị trí sao chép trong một vật chủ mới và nhạy cảm. Sự lan truyền
của virus PRRS thông qua nhiều con đường khác nhau (4).
2.1.4.1. Sự lây truyền dọc
Sự lan truyền của virus PRRS qua nhau thai được báo cáo đầu tiên bởi
Christianson và cộng sự (1992). Cho đến ngày nay, đã có những chứng cứ chắc chắn
rằng virus xuất hiện ở tháng thứ ba trong quá trình mang thai. Tuy nhiên, Molitor và
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phicộng sự (2001) khám phá ra rằng trong một vài trường hợp virus có thể phân lập vào
ngày thứ 30 trong thời kỳ mang thai (4).
Virus PRRS còn có thể lây truyền thông qua quá trình thụ tinh. Prieto và cộng
sự (1996) phát hiện ra rằng khi thụ tinh bằng tinh dịch bị nhiễm virus PRRS Tây Ban
Nha dòng 5710 không ảnh hưởng đến sự thụ thai, nhưng virus lại phát hiện trong phôi
20 ngày tuổi (4).
2.1.4.2. Sự lây truyền ngang
Sự truyền lây trực tiếp
Sự truyền lây virus PRRS thường xuyên xảy ra thông qua con đường truyền lây
trực tiếp. Chẳng hạn như sự truyền lây thông qua sự tương tác gần giữa các con thú
hay thông qua các dịch bị lây nhiễm (tinh dịch, máu ngay cả từ sữa). Việc chăn nuôi
theo bầy và tập tính hay tấn công nhau là một nguyên nhân rất quan trọng dẩn đến sự
truyền lây trực tiếp (11).
Sự truyền lây gián tiếp (4)
Sự truyền lây gián tiếp là sự truyền lây thông qua một vật mang tác nhân lây nhiễm.
Các vật mang ở đây có thể là kiến, loài chân đốt (arthropods) và khí dung (aerosol).
Theo những nghiên cứu trước đây, PRRS rất dễ bị bất hoạt khi bị bài thải ra
môi trường xung quanh. Theo nghiên cứu của Pirtle và Beran (1996) trong điều kiện
ấm và khô virus PRRS sẽ bị bất hoạt rất nhanh. Otake và cộng sự trong một nghiên
cứu năm 2002 cho rằng virus PRRS có thể tồn tại trên trang phục của công nhân trong
thời gian khoảng 60 phút sau khi người công nhân tiếp xúc với heo bị nhiễm bệnh. Sự
lây nhiễm máu trên các công cụ y tế cũng là tác nhân truyền bệnh.
Côn trùng (9)
Côn trùng là một tác nhân lây truyền bệnh rất nguy hiểm. Côn trùng được xem
là một vật mang cơ học, thể hiện ở chổ tác nhân gây bệnh thông qua côn trùng có thể
được mang đi khắp nơi. Côn trùng còn được xem là một vật mang sinh học, thể hiện ở
chổ các tác nhân gây bệnh có thể sao chép để nhân lên trong vật mang trước khi lây
truyền cho vật chủ.
Vai trò của côn trùng trong việc truyền lây virus PRRS là một lĩnh vực được
nghiên cứu thường xuyên. Năm 2002, Otake và cộng sự đã có báo cáo về việc phát
hiện virus PRRS trên lớp vỏ của một loài chân khớp sau khi có trận bùng phát bện
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Quy trình RT-PCR sử dụng trong nghiên cứu hoàn toàn cho phép phát hiện được
RNA của virus PRRS.
Quy trình ly trích sử dụng TRIzol hoàn toàn có khả năng thu nhận RNA.
Quy trình điện di RNA tổng số có khả năng kiểm tra RNA tổng số sau quá trình ly
trích.
Tất cả các mẫu đều không tồn tại virus PRRS ở thời điểm lấy mẫu. Sự hiện diện
kháng thể kháng virus gây bệnh PRRS trong huyết thanh không đồng nghĩa với việc có
sự hiện diện virus trong máu heo có kháng thể.
5.2. Đề nghị
Cần hoàn thiện hơn nữa quy trình ứng dụng RT-PCR trong việc phát hiện virus
PRRS, khử băng phụ và giảm các thành phần phản ứng nhằm làm giảm giá thành cho
một phản ứng xét nghiệm.
Thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiện virus gây bệnh PRRS trên các mẫu mới lấy
từ thú bệnh trong vòng 24 giờ.
Sử dụng song song các cặp mồi Rovira 1,2 và P1, P2 để thực hiện phản ứng RTPCR phát hiện virus PRRS.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
TÓM TẮT
NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đề tài:
“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày
10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Hội đồng hướng dẫn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải
PGS.TS. Trần Thị Dân
Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng sử dụng quy trình RT-PCR để phát
hiện virus gây bệnh PRRS trên lợn. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Xây dựng quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS
đồng thời kiểm tra khả năng của ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start của
công ty Promega, Taq polymerase của công ty Biorad, Taq polymersa của công ty
ABgene).
- Ly trích RNA trên các mẫu phổi bằng quy trình dùng TRIzol và điện di RNA
tổng số nhằm kiểm tra khả năng sử dụng quy trình này trong việc ly trích RNA của
virus.
- Ly trích RNA từ các mẫu huyết thanh và dịch nuôi cấy tế bào từ những lợn
nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết quả ELISA. Sau đó thực hiện phản ứng
RT-PCR để kiểm tra sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong các mẫu này.
Kết quả, đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện RNA chuẩn của
virus gây bệnh PRRS và đã áp dụng thành công trong việc sử dụng TRIzol để ly trích
RNA. Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ các mẫu thu nhận bằng cả hai
quy trình sử dụng bộ kit và sử dụng TRIzol, kết quả thu nhận là tất cả các mẫu xét
nghiệm đều không có sự hiện diện của virus tại thời điểm xét nghiệm.
ii
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỤC LỤC
Tên mục Trang
LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT................................................................................................................. iv
MỤC LỤC .................................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ ix
Phần I: MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục đích và yêu cầu........................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu................................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử bệnh.............................................................................................. 3
2.1.3 Dịch tễ học ................................................................................................ 4
2.1.4 Các con đường lây nhiễm ......................................................................... 5
2.1.4.1 Sự lây truyền dọc................................................................................. 5
2.1.4.2 Sự lây truyền ngang............................................................................. 6
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng................................................................................ 7
2.1.6 Bệnh tích ................................................................................................... 8
2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra ............. 8
2.2.1. Phân lập virus sống ................................................................................... 8
2.2.2. Phân lập virus hay kháng nguyên virus................................................... 9
2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh.............................. 10
2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS ................... 12
2.3. Phương pháp PCR.......................................................................................... 13
2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 13
2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR ................................................ 13
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR .............................................................. 14
2.3.4. Thiết bị và công cụ cho phản ứng PCR .................................................. 15
iii2.4 Phương pháp RT-PCR ................................................................................... 16
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR......................................................... 16
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược.............................................. 16
2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược .......................................................... 18
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP..................................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................. 20
3.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 20
3.3. Vật liệu và hóa chất........................................................................................ 20
3.3.1. Mẫu xét nghiệm ...................................................................................... 20
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 20
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA................................................ 21
3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA .................................................... 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR........................................................... 21
3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR............................... 22
3.4. Thiết bị và dụng cụ......................................................................................... 22
3.5. Các phương pháp ........................................................................................... 22
3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào ................................................................ 22
3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh .................................................... 23
3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình
sử dụng TRIzol................................................................................................... 23
3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính.......................................... 24
3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus................................................... 25
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR...................................................................... 27
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 28
4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV .............................................. 28
4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega).............................................. 28
4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene ............................ 29
4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích ....................................................... 30
4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng
phương pháp sử dụng TRIzol .............................................................................. 30
4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích
từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit ............................ 31
iv
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích........................................................................ 32
4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer........................................................ 33
4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 .............................................................. 33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................... 35
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị........................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. x
vDANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
- AMV: Avian myeloblastosis virus
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EAV: Equine arteritis virus
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- FAb: Fluorescent antibody
- FA: Formaldehyde agarose
- IHC: Immunohistochemistry staining
- IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay
- LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus
- MDS: Mystery swine disease
- MOPS: 3- morpholine propane sulphonate
- ORF: Open reading fraction
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus
- RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus
- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- TE: Tris EDTA
- μl: Micro lit
vi
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiDANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Tên mục Trang
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược ........................ 19
Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng.............................................................. 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR ..................................................................... 25
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR............................................................. 26
Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28
Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công
ty Biorad và Abgene. ...................................................................................................... 29
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
TRIzol.............................................................................................................................. 30
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
bộ kit................................................................................................................................ 31
Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích................................................................ 32
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5
mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol ................................................... 34
viiPhần I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân
chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây
sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hay lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện
ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và
những khó khăn về hô hấp ở lợn.
Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung
hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân
lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hay kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc
bệnh và qui mô đàn lớn.
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán
và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp
nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian.
Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách
mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được
ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian
và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.
Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn
đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị
Dân, chúng tui thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”.
1
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1.2. Mục tiêu – yêu cầu
Mục tiêu
Thăm dò khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase
polymerase chain reaction) trong chẩn đoán virus PRRS.
Yêu cầu
- Thiết lập quy trình phát hiện sự hiện diện RNA của virus PRRS trong mẫu
RNA chuẩn.
- Ly trích RNA và điện di RNA từ một số mẫu bệnh phẩm.
- Sử dụng quy trình RT - PCR vừa thiết lập để kiểm tra sự hiện diện RNA virus
trong huyết thanh và trong dịch nuôi cấy tế bào.
2Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
2.1.1. Giới thiệu
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome) là bệnh gây ra bởi virus thuộc nhóm Arteriviridae có khả
năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Đặc biệt, bệnh có một lịch sử dịch tễ học
phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện thông thường trong chăn nuôi
lợn công nghiệp. Đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong
nền công nghiệp nuôi lợn trên thế giới
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều
tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”(2).
Đầu tiên, trên cơ sở về hình thái học, tổ chức gene, sự sao chép, dịch mã và vị
trí protein giống nhau, PRRSV đã được định danh cùng nhóm với virus gây viêm động
mạch ở ngựa (EAV: equine arteritis virus), virus LDV (lactate dehydrogenase
elevating virus) và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV: simian hemorrhagic fewer
virus). Những họ virus này có khả năng sao chép trong đại thực bào và nhiễm bệnh lâu
dài trên vật chủ tự nhiên của chúng (dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 7).
Nhìn chung, PRRS có những biểu hiện lâm sàng giống nhau giữa dòng Châu
Mỹ và dòng Châu Âu. Tuy nhiên, những dòng này có những đặc tính gây bệnh, kiểu
kháng nguyên và những đặc tính di truyền khác nhau. Những đặc điểm khác nhau này
là cơ sở cho việc phân loại các dòng thành hai nhóm nhỏ: nhóm A gồm hầu hết các
dòng ở Nam Mỹ và nhóm B gồm hầu hết các dòng ở Châu Âu (19).
2.1.2. Lịch sử bệnh (11)
Vào cuối thập niên 80 đã xảy ra một trận đại dịch ở Mỹ. Người ta mô tả đầu
tiên về một hội chứng bệnh ở vùng phía nam Carolina, bao gồm việc suy giảm mạnh
khả năng sinh sản, viêm phổi sau cai sữa, gia tăng tỉ lệ tử vong ở heo. Nguyên nhân
lúc bấy giờ chưa được biết, do đó được gọi với tên gọi “bệnh thần bí ở lợn” (MSD:
mystery swine disease).
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiĐầu tiên có rất nhiều ý kiến về nguyên nhân gây ra trận đại dịch, bao gồm,
nguyên nhân do virus viêm não và cơ tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus,
porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus,… và cả nguyên nhân do
thức ăn bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxins). Ở Canada, một dạng virus gây bệnh cúm
type A được phân lập ở heo con bệnh về hô hấp và cũng được đưa vào danh sách nghi
ngờ nguyên nhân gây ra “bệnh thần bí”. Việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ngày
càng khó khăn bởi vì nhiều tác nhân gây bệnh được phân lập từ “bệnh thần bí”. Ở Châu
Âu, một trận dịch tương tự như MSD cũng được báo cáo ở vùng Münster của Đức
(1992), bệnh này lập tức lan ra một cách nhanh chóng và có đến khoảng 3000 trận dịch
đã xảy ra ở Đức cho đến tháng 5 năm 1991. Không tìm thấy sự liên quan nào giữa trận
dịch ở Đức và ở Mỹ (Anoon, 1991). Căn bệnh này cũng được báo cáo ở Netherlands
vào tháng 1 năm 1991 và ở Belgium vào tháng 3 năm 1991 (OIE, 1992). Trường hợp
đầu tiên của bệnh phát hiện ở Tây Ban Nha là qua biểu hiện lâm sàng của đàn heo sống
nhập khẩu. Ba trận dịch được báo cáo ở Tây Ban Nha, trong đó hai trường hợp xảy ra ở
tỉnh Huesca và một trường hợp xảy ra ở tỉnh Lerida, tất cả các heo ở đây đều bị giết thịt
nhanh chóng. Ở Anh, “bệnh tai xanh” (một dạng biểu hiện lâm sàng của bệnh PRRS)
xuất hiện vào tháng 5 năm 1991 . Điều đáng chú ý là ở Anh tại thời điểm này không có
hiện tượng nhập khẩu heo sống, tinh trùng hay phôi từ những quốc gia đang có bệnh
MDS trong vòng 12 tháng; vì vậy không có sự giải thích rõ ràng về nguồn gốc gây ra
căn bệnh này ở Anh. Ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở Brittany vào tháng 10
năm 1991, sau đó là trận dịch ở Đan Mạch vào tháng 3 năm 1992.
Ở châu Á, trận dịch đầu tiên xuất hiện ở Nhật năm 1988 và Đài Loan vào năm
1991. Như vậy, đại dịch MSD đã lan truyền trên hầu hết các trung tâm chăn nuôi lợn
lớn trên thế giới chỉ trong khoảng thời gian vài năm.
Bệnh này trước đây được gọi với nhiều tên khác nhau. Cho đến năm 1992, tổ
chức dịch tể thế giới (OIE) và hội nghị quốc tế về bệnh này ở St.Paul, Minnestota đã
nhất trí sử dụng tên PRRS để chỉ loại bệnh này.
2.1.3. Dịch tễ học
Bệnh PRRS nổi lên trong ngành chăn nuôi lợn ở Bắc Mỹ và Châu Âu từ những
năm 1987. Bệnh này cũng gặp ở Mỹ, Hà Lan, Pháp, Canada, Đức và Anh. Điều tra
huyết thanh học ở đàn lợn nái có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS cho
4thấy rằng 75 % bệnh có phản ứng dương tính với virus Lelystad, gần 10 % có dương
tính với các virus khác như Encephalomyocarditis(2).
Ở Châu Âu, bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào tháng 11/1991, ở Hà
Lan vào tháng 1/1991. Bệnh này nhanh chóng lây lan theo hướng tây nam và sau đó
chuyển sang hướng bắc theo hướng gió thổi. Việc lan truyền theo đường không khí cũng
được đề cập đến vì ngay cả những đàn được chăm sóc và cách ly tốt với đàn bị bệnh
cũng bị nhiễm bệnh.
Việc lây lan bệnh liên quan tới việc vận chuyển lợn cái hậu bị từ các đàn giống
riêng lẻ tới các trại giống khác. Mở rộng điều tra không phát hiện được bệnh lúc đầu
được đưa vào Anh như thế nào. Việc áp dụng luật hạn chế vận chuyển lợn từ đàn bị
bệnh đã làm chậm tốc độ lây lan bệnh nhưng việc lây lan bệnh vẫn xảy ra thường xuyên
ở khoảng cách vài km trong những vùng có mật độ gia súc lớn.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên bằng các phản ứng huyết thanh
học vào năm 1997, trên đàn lợn nhập từ Mỹ phát hiện có 10 con bị bệnh trong tổng số
51 con. Trong báo cáo của Trung tâm thú y vùng TP.Hồ Chí Minh đã điều tra huyết
thanh học ở 17 trại chăn nuôi lợn thuộc các tỉnh Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tiền Giang và
Vĩnh Long kết quả cho thấy 6 trại giống có huyết thanh dương tính, 596 trong tổng số
3402 con xét nghiệm có phản ứng dương tính. Tỉ lệ dương tính ở mỗi trại là từ 1,3 %
đến 68,29 % (2).
Bệnh ảnh hưởng tới lợn nái, lợn chửa và lợn con theo mẹ, lợn mới cai sữa, lợn
đang lớn và lợn thịt ở giai đoạn cuối.
2.1.4. Các con đƣờng lây nhiễm
Sự lan truyền tác nhân gây bệnh xảy ra khi tác nhân gây bệnh được thoát ra khỏi
vật chủ, giải phóng ra môi trường bên ngoài, vượt qua được hàng rào phòng thủ của vật
chủ và tiếp cận đến vị trí sao chép trong một vật chủ mới và nhạy cảm. Sự lan truyền
của virus PRRS thông qua nhiều con đường khác nhau (4).
2.1.4.1. Sự lây truyền dọc
Sự lan truyền của virus PRRS qua nhau thai được báo cáo đầu tiên bởi
Christianson và cộng sự (1992). Cho đến ngày nay, đã có những chứng cứ chắc chắn
rằng virus xuất hiện ở tháng thứ ba trong quá trình mang thai. Tuy nhiên, Molitor và
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phicộng sự (2001) khám phá ra rằng trong một vài trường hợp virus có thể phân lập vào
ngày thứ 30 trong thời kỳ mang thai (4).
Virus PRRS còn có thể lây truyền thông qua quá trình thụ tinh. Prieto và cộng
sự (1996) phát hiện ra rằng khi thụ tinh bằng tinh dịch bị nhiễm virus PRRS Tây Ban
Nha dòng 5710 không ảnh hưởng đến sự thụ thai, nhưng virus lại phát hiện trong phôi
20 ngày tuổi (4).
2.1.4.2. Sự lây truyền ngang
Sự truyền lây trực tiếp
Sự truyền lây virus PRRS thường xuyên xảy ra thông qua con đường truyền lây
trực tiếp. Chẳng hạn như sự truyền lây thông qua sự tương tác gần giữa các con thú
hay thông qua các dịch bị lây nhiễm (tinh dịch, máu ngay cả từ sữa). Việc chăn nuôi
theo bầy và tập tính hay tấn công nhau là một nguyên nhân rất quan trọng dẩn đến sự
truyền lây trực tiếp (11).
Sự truyền lây gián tiếp (4)
Sự truyền lây gián tiếp là sự truyền lây thông qua một vật mang tác nhân lây nhiễm.
Các vật mang ở đây có thể là kiến, loài chân đốt (arthropods) và khí dung (aerosol).
Theo những nghiên cứu trước đây, PRRS rất dễ bị bất hoạt khi bị bài thải ra
môi trường xung quanh. Theo nghiên cứu của Pirtle và Beran (1996) trong điều kiện
ấm và khô virus PRRS sẽ bị bất hoạt rất nhanh. Otake và cộng sự trong một nghiên
cứu năm 2002 cho rằng virus PRRS có thể tồn tại trên trang phục của công nhân trong
thời gian khoảng 60 phút sau khi người công nhân tiếp xúc với heo bị nhiễm bệnh. Sự
lây nhiễm máu trên các công cụ y tế cũng là tác nhân truyền bệnh.
Côn trùng (9)
Côn trùng là một tác nhân lây truyền bệnh rất nguy hiểm. Côn trùng được xem
là một vật mang cơ học, thể hiện ở chổ tác nhân gây bệnh thông qua côn trùng có thể
được mang đi khắp nơi. Côn trùng còn được xem là một vật mang sinh học, thể hiện ở
chổ các tác nhân gây bệnh có thể sao chép để nhân lên trong vật mang trước khi lây
truyền cho vật chủ.
Vai trò của côn trùng trong việc truyền lây virus PRRS là một lĩnh vực được
nghiên cứu thường xuyên. Năm 2002, Otake và cộng sự đã có báo cáo về việc phát
hiện virus PRRS trên lớp vỏ của một loài chân khớp sau khi có trận bùng phát bệnMỤC LỤC
Tên mục Trang
LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT................................................................................................................. iv
MỤC LỤC .................................................................................................................. v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................ ix
Phần I: MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục đích và yêu cầu........................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu................................................................................................... 3
2.1.2 Lịch sử bệnh.............................................................................................. 3
2.1.3 Dịch tễ học ................................................................................................ 4
2.1.4 Các con đường lây nhiễm ......................................................................... 5
2.1.4.1 Sự lây truyền dọc................................................................................. 5
2.1.4.2 Sự lây truyền ngang............................................................................. 6
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng................................................................................ 7
2.1.6 Bệnh tích ................................................................................................... 8
2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra ............. 8
2.2.1. Phân lập virus sống ................................................................................... 8
2.2.2. Phân lập virus hay kháng nguyên virus................................................... 9
2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh.............................. 10
2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS ................... 12
2.3. Phương pháp PCR.......................................................................................... 13
2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 13
2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR ................................................ 13
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR .............................................................. 14
2.3.4. Thiết bị và công cụ cho phản ứng PCR .................................................. 15
iii2.4 Phương pháp RT-PCR ................................................................................... 16
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR......................................................... 16
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược.............................................. 16
2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược .......................................................... 18
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP..................................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.................................................................. 20
3.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 20
3.3. Vật liệu và hóa chất........................................................................................ 20
3.3.1. Mẫu xét nghiệm ...................................................................................... 20
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR ...................................................... 20
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA................................................ 21
3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA .................................................... 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR........................................................... 21
3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR............................... 22
3.4. Thiết bị và dụng cụ......................................................................................... 22
3.5. Các phương pháp ........................................................................................... 22
3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào ................................................................ 22
3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh .................................................... 23
3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình
sử dụng TRIzol................................................................................................... 23
3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính.......................................... 24
3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus................................................... 25
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR...................................................................... 27
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 28
4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV .............................................. 28
4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega).............................................. 28
4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene ............................ 29
4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích ....................................................... 30
4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng
phương pháp sử dụng TRIzol .............................................................................. 30
4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích
từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit ............................ 31
iv
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích........................................................................ 32
4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer........................................................ 33
4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 .............................................................. 33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................... 35
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị........................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. x
vDANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
- AMV: Avian myeloblastosis virus
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EAV: Equine arteritis virus
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- FAb: Fluorescent antibody
- FA: Formaldehyde agarose
- IHC: Immunohistochemistry staining
- IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay
- LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus
- MDS: Mystery swine disease
- MOPS: 3- morpholine propane sulphonate
- ORF: Open reading fraction
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus
- RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus
- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- TE: Tris EDTA
- μl: Micro lit
vi
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiDANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Tên mục Trang
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược ........................ 19
Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng.............................................................. 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR ..................................................................... 25
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR............................................................. 26
Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28
Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công
ty Biorad và Abgene. ...................................................................................................... 29
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
TRIzol.............................................................................................................................. 30
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
bộ kit................................................................................................................................ 31
Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích................................................................ 32
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5
mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol ................................................... 34
viiPhần I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân
chính gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây
sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hay lợn con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện
ở hệ hô hấp của lợn con theo mẹ và lợn cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và
những khó khăn về hô hấp ở lợn.
Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các kiểu chăn nuôi: nuôi nhốt hay thả rong; tập trung
hay phân tán, qui mô đàn lớn hay nhỏ và tình trạng sức khoẻ tốt hay xấu. Nguyên nhân
lây bệnh phổ biến là do thiếu cách ly hay kiểm dịch đối với lợn mua, ở gần đàn mắc
bệnh và qui mô đàn lớn.
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán
và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp
nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó khăn và mất nhiều thời gian.
Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách
mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được
ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian
và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.
Nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác chẩn
đoán, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị
Dân, chúng tui thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR để phát hiện virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”.
1
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1.2. Mục tiêu – yêu cầu
Mục tiêu
Thăm dò khả năng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase
polymerase chain reaction) trong chẩn đoán virus PRRS.
Yêu cầu
- Thiết lập quy trình phát hiện sự hiện diện RNA của virus PRRS trong mẫu
RNA chuẩn.
- Ly trích RNA và điện di RNA từ một số mẫu bệnh phẩm.
- Sử dụng quy trình RT - PCR vừa thiết lập để kiểm tra sự hiện diện RNA virus
trong huyết thanh và trong dịch nuôi cấy tế bào.
2Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)
2.1.1. Giới thiệu
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRS (porcine reproductive
and respiratory syndrome) là bệnh gây ra bởi virus thuộc nhóm Arteriviridae có khả
năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Đặc biệt, bệnh có một lịch sử dịch tễ học
phức tạp và rất khó kiểm soát đối với những điều kiện thông thường trong chăn nuôi
lợn công nghiệp. Đây là một trong những bệnh gây ra sự tổn thất vô cùng lớn trong
nền công nghiệp nuôi lợn trên thế giới
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 ở Mỹ và được gọi với nhiều
tên gọi khác nhau như “bệnh thần bí ở lợn”, “bệnh tai xanh ở lợn”, “hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”(2).
Đầu tiên, trên cơ sở về hình thái học, tổ chức gene, sự sao chép, dịch mã và vị
trí protein giống nhau, PRRSV đã được định danh cùng nhóm với virus gây viêm động
mạch ở ngựa (EAV: equine arteritis virus), virus LDV (lactate dehydrogenase
elevating virus) và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV: simian hemorrhagic fewer
virus). Những họ virus này có khả năng sao chép trong đại thực bào và nhiễm bệnh lâu
dài trên vật chủ tự nhiên của chúng (dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 7).
Nhìn chung, PRRS có những biểu hiện lâm sàng giống nhau giữa dòng Châu
Mỹ và dòng Châu Âu. Tuy nhiên, những dòng này có những đặc tính gây bệnh, kiểu
kháng nguyên và những đặc tính di truyền khác nhau. Những đặc điểm khác nhau này
là cơ sở cho việc phân loại các dòng thành hai nhóm nhỏ: nhóm A gồm hầu hết các
dòng ở Nam Mỹ và nhóm B gồm hầu hết các dòng ở Châu Âu (19).
2.1.2. Lịch sử bệnh (11)
Vào cuối thập niên 80 đã xảy ra một trận đại dịch ở Mỹ. Người ta mô tả đầu
tiên về một hội chứng bệnh ở vùng phía nam Carolina, bao gồm việc suy giảm mạnh
khả năng sinh sản, viêm phổi sau cai sữa, gia tăng tỉ lệ tử vong ở heo. Nguyên nhân
lúc bấy giờ chưa được biết, do đó được gọi với tên gọi “bệnh thần bí ở lợn” (MSD:
mystery swine disease).
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiĐầu tiên có rất nhiều ý kiến về nguyên nhân gây ra trận đại dịch, bao gồm,
nguyên nhân do virus viêm não và cơ tim (Encephalomyocarditis), hog cholera virus,
porcine enterovirus, porcine parvovirus, pseudorabies virus,… và cả nguyên nhân do
thức ăn bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxins). Ở Canada, một dạng virus gây bệnh cúm
type A được phân lập ở heo con bệnh về hô hấp và cũng được đưa vào danh sách nghi
ngờ nguyên nhân gây ra “bệnh thần bí”. Việc tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ngày
càng khó khăn bởi vì nhiều tác nhân gây bệnh được phân lập từ “bệnh thần bí”. Ở Châu
Âu, một trận dịch tương tự như MSD cũng được báo cáo ở vùng Münster của Đức
(1992), bệnh này lập tức lan ra một cách nhanh chóng và có đến khoảng 3000 trận dịch
đã xảy ra ở Đức cho đến tháng 5 năm 1991. Không tìm thấy sự liên quan nào giữa trận
dịch ở Đức và ở Mỹ (Anoon, 1991). Căn bệnh này cũng được báo cáo ở Netherlands
vào tháng 1 năm 1991 và ở Belgium vào tháng 3 năm 1991 (OIE, 1992). Trường hợp
đầu tiên của bệnh phát hiện ở Tây Ban Nha là qua biểu hiện lâm sàng của đàn heo sống
nhập khẩu. Ba trận dịch được báo cáo ở Tây Ban Nha, trong đó hai trường hợp xảy ra ở
tỉnh Huesca và một trường hợp xảy ra ở tỉnh Lerida, tất cả các heo ở đây đều bị giết thịt
nhanh chóng. Ở Anh, “bệnh tai xanh” (một dạng biểu hiện lâm sàng của bệnh PRRS)
xuất hiện vào tháng 5 năm 1991 . Điều đáng chú ý là ở Anh tại thời điểm này không có
hiện tượng nhập khẩu heo sống, tinh trùng hay phôi từ những quốc gia đang có bệnh
MDS trong vòng 12 tháng; vì vậy không có sự giải thích rõ ràng về nguồn gốc gây ra
căn bệnh này ở Anh. Ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở Brittany vào tháng 10
năm 1991, sau đó là trận dịch ở Đan Mạch vào tháng 3 năm 1992.
Ở châu Á, trận dịch đầu tiên xuất hiện ở Nhật năm 1988 và Đài Loan vào năm
1991. Như vậy, đại dịch MSD đã lan truyền trên hầu hết các trung tâm chăn nuôi lợn
lớn trên thế giới chỉ trong khoảng thời gian vài năm.
Bệnh này trước đây được gọi với nhiều tên khác nhau. Cho đến năm 1992, tổ
chức dịch tể thế giới (OIE) và hội nghị quốc tế về bệnh này ở St.Paul, Minnestota đã
nhất trí sử dụng tên PRRS để chỉ loại bệnh này.
2.1.3. Dịch tễ học
Bệnh PRRS nổi lên trong ngành chăn nuôi lợn ở Bắc Mỹ và Châu Âu từ những
năm 1987. Bệnh này cũng gặp ở Mỹ, Hà Lan, Pháp, Canada, Đức và Anh. Điều tra
huyết thanh học ở đàn lợn nái có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS cho
4thấy rằng 75 % bệnh có phản ứng dương tính với virus Lelystad, gần 10 % có dương
tính với các virus khác như Encephalomyocarditis(2).
Ở Châu Âu, bệnh này được phát hiện lần đầu tiên ở Đức vào tháng 11/1991, ở Hà
Lan vào tháng 1/1991. Bệnh này nhanh chóng lây lan theo hướng tây nam và sau đó
chuyển sang hướng bắc theo hướng gió thổi. Việc lan truyền theo đường không khí cũng
được đề cập đến vì ngay cả những đàn được chăm sóc và cách ly tốt với đàn bị bệnh
cũng bị nhiễm bệnh.
Việc lây lan bệnh liên quan tới việc vận chuyển lợn cái hậu bị từ các đàn giống
riêng lẻ tới các trại giống khác. Mở rộng điều tra không phát hiện được bệnh lúc đầu
được đưa vào Anh như thế nào. Việc áp dụng luật hạn chế vận chuyển lợn từ đàn bị
bệnh đã làm chậm tốc độ lây lan bệnh nhưng việc lây lan bệnh vẫn xảy ra thường xuyên
ở khoảng cách vài km trong những vùng có mật độ gia súc lớn.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên bằng các phản ứng huyết thanh
học vào năm 1997, trên đàn lợn nhập từ Mỹ phát hiện có 10 con bị bệnh trong tổng số
51 con. Trong báo cáo của Trung tâm thú y vùng TP.Hồ Chí Minh đã điều tra huyết
thanh học ở 17 trại chăn nuôi lợn thuộc các tỉnh Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tiền Giang và
Vĩnh Long kết quả cho thấy 6 trại giống có huyết thanh dương tính, 596 trong tổng số
3402 con xét nghiệm có phản ứng dương tính. Tỉ lệ dương tính ở mỗi trại là từ 1,3 %
đến 68,29 % (2).
Bệnh ảnh hưởng tới lợn nái, lợn chửa và lợn con theo mẹ, lợn mới cai sữa, lợn
đang lớn và lợn thịt ở giai đoạn cuối.
2.1.4. Các con đƣờng lây nhiễm
Sự lan truyền tác nhân gây bệnh xảy ra khi tác nhân gây bệnh được thoát ra khỏi
vật chủ, giải phóng ra môi trường bên ngoài, vượt qua được hàng rào phòng thủ của vật
chủ và tiếp cận đến vị trí sao chép trong một vật chủ mới và nhạy cảm. Sự lan truyền
của virus PRRS thông qua nhiều con đường khác nhau (4).
2.1.4.1. Sự lây truyền dọc
Sự lan truyền của virus PRRS qua nhau thai được báo cáo đầu tiên bởi
Christianson và cộng sự (1992). Cho đến ngày nay, đã có những chứng cứ chắc chắn
rằng virus xuất hiện ở tháng thứ ba trong quá trình mang thai. Tuy nhiên, Molitor và
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phicộng sự (2001) khám phá ra rằng trong một vài trường hợp virus có thể phân lập vào
ngày thứ 30 trong thời kỳ mang thai (4).
Virus PRRS còn có thể lây truyền thông qua quá trình thụ tinh. Prieto và cộng
sự (1996) phát hiện ra rằng khi thụ tinh bằng tinh dịch bị nhiễm virus PRRS Tây Ban
Nha dòng 5710 không ảnh hưởng đến sự thụ thai, nhưng virus lại phát hiện trong phôi
20 ngày tuổi (4).
2.1.4.2. Sự lây truyền ngang
Sự truyền lây trực tiếp
Sự truyền lây virus PRRS thường xuyên xảy ra thông qua con đường truyền lây
trực tiếp. Chẳng hạn như sự truyền lây thông qua sự tương tác gần giữa các con thú
hay thông qua các dịch bị lây nhiễm (tinh dịch, máu ngay cả từ sữa). Việc chăn nuôi
theo bầy và tập tính hay tấn công nhau là một nguyên nhân rất quan trọng dẩn đến sự
truyền lây trực tiếp (11).
Sự truyền lây gián tiếp (4)
Sự truyền lây gián tiếp là sự truyền lây thông qua một vật mang tác nhân lây nhiễm.
Các vật mang ở đây có thể là kiến, loài chân đốt (arthropods) và khí dung (aerosol).
Theo những nghiên cứu trước đây, PRRS rất dễ bị bất hoạt khi bị bài thải ra
môi trường xung quanh. Theo nghiên cứu của Pirtle và Beran (1996) trong điều kiện
ấm và khô virus PRRS sẽ bị bất hoạt rất nhanh. Otake và cộng sự trong một nghiên
cứu năm 2002 cho rằng virus PRRS có thể tồn tại trên trang phục của công nhân trong
thời gian khoảng 60 phút sau khi người công nhân tiếp xúc với heo bị nhiễm bệnh. Sự
lây nhiễm máu trên các công cụ y tế cũng là tác nhân truyền bệnh.
Côn trùng (9)
Côn trùng là một tác nhân lây truyền bệnh rất nguy hiểm. Côn trùng được xem
là một vật mang cơ học, thể hiện ở chổ tác nhân gây bệnh thông qua côn trùng có thể
được mang đi khắp nơi. Côn trùng còn được xem là một vật mang sinh học, thể hiện ở
chổ các tác nhân gây bệnh có thể sao chép để nhân lên trong vật mang trước khi lây
truyền cho vật chủ.
Vai trò của côn trùng trong việc truyền lây virus PRRS là một lĩnh vực được
nghiên cứu thường xuyên. Năm 2002, Otake và cộng sự đã có báo cáo về việc phát
hiện virus PRRS trên lớp vỏ của một loài chân khớp sau khi có trận bùng phát bện
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Quy trình RT-PCR sử dụng trong nghiên cứu hoàn toàn cho phép phát hiện được
RNA của virus PRRS.
Quy trình ly trích sử dụng TRIzol hoàn toàn có khả năng thu nhận RNA.
Quy trình điện di RNA tổng số có khả năng kiểm tra RNA tổng số sau quá trình ly
trích.
Tất cả các mẫu đều không tồn tại virus PRRS ở thời điểm lấy mẫu. Sự hiện diện
kháng thể kháng virus gây bệnh PRRS trong huyết thanh không đồng nghĩa với việc có
sự hiện diện virus trong máu heo có kháng thể.
5.2. Đề nghị
Cần hoàn thiện hơn nữa quy trình ứng dụng RT-PCR trong việc phát hiện virus
PRRS, khử băng phụ và giảm các thành phần phản ứng nhằm làm giảm giá thành cho
một phản ứng xét nghiệm.
Thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiện virus gây bệnh PRRS trên các mẫu mới lấy
từ thú bệnh trong vòng 24 giờ.
Sử dụng song song các cặp mồi Rovira 1,2 và P1, P2 để thực hiện phản ứng RTPCR phát hiện virus PRRS.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: