Luận văn: Nghiên cứu sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp : Luận án TS. Sinh học : 62 42 30 15
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2008
Chủ đề: Bệnh ung thư
Hóa sinh học
Kháng nguyên
Kháng thể
Lectin
Miêu tả: 114 tr. + CD-ROM + tóm tắt
Lựa chọn, tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít(Artocarpus heterophyllus lamk, Artocarpus masticata Gagn và Artocarpus champeden Gagn). Đồng thời xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loại đậu (Canavalia maritima Aublet và Canavilia gladiata Jacq D.C) để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng nhằm xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA1, IgG kháng nguyên AFP từ huyết thanh người bình thường và một số bệnh nhân ung thư gan, ung thư vòm họng, đa u tủy xương, viêm gan siêu vi trùng
Luận án TS. Hóa sinh học -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2008
CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ ........................................................................................ 3
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể.............................................................. 3
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể ............................................................ 4
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể ............................................................ 5
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí ..................................... 6
1.2. AFP và UNG THƯ .................................................................................................. 7
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh................ 7
1.2.2. Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP...................... 8
1.2.3. Chức năng của AFP.................................................................................... 9
1.2.4. Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính
và một số bệnh khác ................................................................................. 10
1.3 LECTIN ............................................................................................................... 11
1.3.1. Lược sử nghiên cứu lectin ......................................................................... 11
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới........................................................ 14
1.3.3. Một số tính chất lí hoá của lectin .............................................................. 15
1.3.4. Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin .................................... 18
1.3.5. Ứng dụng của lectin .................................................................................. 20
1.3.6. Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam.................................................. 24
Chương 2. NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 26
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2.1. NGUYÊN LIỆU..................................................................................................... 26
2.1.1. Hạt mít....................................................................................................... 26
2.1.2. Hạt đậu ...................................................................................................... 27
2.1.3. Huyết thanh, hồng cầu người .................................................................... 27
2.2. HOÁ CHẤT và THIẾT BỊ ....................................................................................... 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... 28
2.3.1. Xác định hoạt độ lectin.............................................................................. 28
2.3.2. Xác định hàm lượng protein...................................................................... 29
2.3.3. Tinh chế lectin ........................................................................................... 30
2.3.4. Điều chế các cột sắc kí ái lực .................................................................... 31
2.3.5. Tinh chế kháng thể .................................................................................... 32
2.3.6. Kỹ thuật ELISA......................................................................................... 33
2.3.7. Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting)..................................... 36
2.3.8. Kỹ thuật điện di ......................................................................................... 37
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN................................................................. 38
3.1. TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden
Gagn. và A. masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima
Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.)................ 38
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A. heterophyllus Lamk;
A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.) ............................................................... 38
3.1.2. Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet)........... 43
3.1.3. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ............. 50
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA1 TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI ......................................................................................................... 53
3.2.1. Tinh chế IgA1 bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo......................... 54
3.2.2. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA1 bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA ..... 59
3.2.3. Định lượng IgA1 trong HT người bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA........... 68
3.3. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI.................................................................................................... 703.3.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể IgG từ huyết thanh của ConM... 70
3.3.2. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bằng cột
ConM-Sepharose-4B tự tạo...................................................................... 72
3.3.3. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật
LECTIN- ELISA ...................................................................................... 77
3.3.4. Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG bằng kỹ thuật
LECTIN-ELISA........................................................................................ 85
3.4. ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ,
PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ
GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ..................................................... 87
3.4.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm
(Canavalia gladiata Jacq D.C.) .................................................................................. 87
3.4.2. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể trong huyết thanh của ConG
......................... 88
3.4.3. Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP bệnh lí ........ 89
3.5. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 91
KẾT LUẬN.... .................................................... .................................................96
ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................. 98
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ....................................................................................... 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 100
PHỤ LỤC....... ..................................................................................................... 110
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỞ ĐẦU
Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bình thường và của các bệnh nhân
nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh nhân ung thư rất đa dạng và phức tạp. Khả năng đáp
ứng miễn dịch của cơ thể được biểu hiện là sự tăng cường tổng hợp kháng thể hoặc
xuất hiện một số kháng nguyên chỉ thị bệnh đã được nhiều nhà khoa học Y học quan
tâm nghiên cứu. Mục đích của các nghiên cứu theo hướng này là xác định sự biểu
hiện bất thường của một số kháng thể và kháng nguyên chỉ thị bệnh nhằm chẩn đoán
bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời và hiệu quả.
Có rất nhiều phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng để nghiên
cứu sự thay đổi đáp ứng đó như: ELISA, RIA, DOT-BLOT, Western BLOT, các
kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết các kháng
nguyên bệnh hay nhận biết các kháng thể bệnh lí xuất hiện,... Kháng thể bệnh lí
xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt biểu
hiện bất thường về số lượng và chất lượng, chẳng hạn các kháng thể đã bị cải
biến sau tổng hợp như thoái hoá hay tăng khả năng glycosyl hoá (loại bỏ hoặc
gắn thêm các gốc đường), thậm chí có sự thay đổi thoái hoá đứt gãy cấu trúc hoá
học protein của phân tử (như mảnh peptide Bence-Jones chuỗi nhẹ ở bệnh ung
thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B)…Tất cả những thay đổi về đáp ứng miễn dịch
và hoá sinh cần được phân tích chính xác và bằng những kỹ thuật xét
nghiệm đặc hiệu để phát hiện sớm sự biểu hiện của bệnh.
Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài
nguyên sinh vật như động vật, thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát
hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888). Trong nhiều năm nghiên
cứu, các nhà khoa học đã chứng minh lectin có rất nhiều ứng dụng trong Y dược
học. Đặc biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự
tương tác đặc hiệu rất tinh vi của lectin với các kháng thể và kháng nguyên (do bản
chất hoá học của lectin là những protein liên kết đặc hiệu với các gốc đường của
nhiều loại kháng thể và kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu
sự biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên trong đáp ứng miễn dịch.Mục tiêu đề tài
Lựa chọn, tinh chế một số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với
kháng thể, kháng nguyên để xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA1, IgG và
kháng nguyên AFP từ huyết thanh của người bình thường, một số bệnh nhân: Ung
thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan và viêm gan siêu vi trùng.
Nội dung của đề tài
1. Tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít (Artocarpus heterophyllus Lamk;
Artocarpus masticata Gagn. và Artocarpus champeden Gagn.) của Việt Nam và sử
dụng jacalin để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgA1 từ huyết thanh
người.
2. Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loài đậu (Canavalia
maritima Aublet và Canavalia gladiata Jacq D.C.) của Việt Nam để thiết kế bộ sinh
phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người, phân biệt kháng nguyên AFP
(Alpha Feto Protein) của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
Những đóng góp mới của luận án
1. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam
(Canavalia maritima Aublet) có khả năng bắt giữ đặc hiệu với kháng thể IgG từ
huyết thanh người.
2. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia
gladiata Jacq D.C.) có khả năng bắt giữ và phân biệt được các loại kháng nguyên
AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
3. Bước đầu nghiên cứu tạo hai bộ sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA1,
IgG từ huyết thanh người và nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm trong thời
gian 4 tháng vẫn cho giá trị sử dụng.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển
Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) và đặc tính liên kết đặc hiệu giữa lectin
ConM với kháng thể IgG từ huyết thanh người.
2. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq
D.C.) và chứng minh được các isolectin ConG nhận biết riêng biệt 3 dạng kháng
nguyên AFP của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và của thai phụ.
3. Đã bước đầu thiết kế được 2 bộ sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA
và ConM-ELISA) để định lượng kháng thể IgA1 và IgG.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ
1.1.1. Khái niệm
Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, khi những tế bào bạch cầu của hệ
miễn dịch nhận thông tin được tiếp xúc với kháng nguyên (KN) sẽ sản xuất ra những
chất đặc hiệu chống lại KN ấy. Những chất đó được gọi là kháng thể (KT), hay
globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt là Ig). Loại KT thứ nhất được đổ vào
dịch nội môi, đó là KT dịch thể, loại KT này do tế bào plasma dạng biệt hoá sau cùng
của tế bào B sản xuất. Loại KT thứ hai nằm ngay trên màng của những tế bào B sinh
ra nó, đó là KT màng tế bào và đóng vai trò thụ thể của những tế bào này. Phản ứng
kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu hoá học cao. Ở người có 5 lớp kháng
thể là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE [1].
Hàm lượng các lớp kháng thể trong hệ thống dịch thể của cơ thể phụ thuộc
vào trạng thái sinh lí, tuổi, giới tính, điều kiện địa lí. Ngoài ra còn có một số mối
quan hệ về số lượng và chất lượng của các KT đối với sự biểu hiện bệnh lí như: Một
số bệnh ung thư, nhiễm trùng và một số bệnh tự miễn. Trong huyết thanh, thành
phần kháng thể chiếm khoảng 20% tổng lượng protein. Ngày nay nhờ những tiến bộ
trong lĩnh vực sinh học phân tử, người ta đã hiểu ngày càng sâu và đầy đủ về cấu
trúc, chức năng của các phân tử KT [15],[35].
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể
Tất cả các KT đều có bản chất là glycoprotein, mỗi phân tử đều có 2 chuỗi nhẹ
và 2 chuỗi nặng [36].
* Hai chuỗi nhẹ (ngắn) kí hiệu là chuỗi L (light chain) có khối lượng phân tử
khoảng 25-28 kDa, mỗi chuỗi có khoảng 221- 312 amino acid. Chuỗi L gồm 2 loại
là hay .
................ Chuỗi nhẹ được hình thành từ hai vùng khu vực là khu vực không
biến đổi (C hay C ) và khu vực dễ biến đổi (V và V):
- Vùng không biến đổi có các gốc amino acid từ vị trí 108 đến tận cùng C, rất
ít thay đổi về thành phần và trật tự sắp xếp các amino acid.
- Vùng biến đổi có thứ tự amino acid từ vị trí 107 đến tận cùng N của chuỗi
polypeptide.* Hai chuỗi nặng (dài) được kí hiệu là chuỗi H (heavy chain), mang tính chất
đặc trưng riêng của từng lớp KT. Khối lượng phân tử khoảng 50-57 kDa, mỗi chuỗi
chứa 440 - 460 amino acid. Chuỗi nặng gồm khu vực N tận cùng dễ biến đổi (VH)
và 3 khu vực không biến đổi CH (đối với IgD, IgG và IgA) hay 4 khu vực không
biến đổi (đối với IgM và IgE). Khu vực không biến đổi của chuỗi nặng kí hiệu là
CH. Mỗi một khu vực biến đổi gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable), còn gọi là các
vùng xác định bổ sung (CDR). Các paratop được hình thành từ những vị trí đặt kề
nhau trong khoảng không của các vùng siêu biến được tách biệt nhau bằng hai vùng
bảo thủ hơn (hay các vùng khuôn). Vùng nằm giữa hai khu vực CH1 và CH2 của
chuỗi H được gọi là vùng khớp hay vùng bản lề, đảm bảo cho tính mềm dẻo của các
phân tử KT, đồng thời hai cánh tay (VL, CL,VH, CH1) của phân tử có thể di động
trong không gian.
Các chuỗi nặng của KT luôn luôn được kết hợp với các gốc đường ở các vị trí
khác nhau. Nhìn chung, các gốc đường kết hợp với KT là các oligosaccharide có
chứa một hay nhiều gốc sialic acid. Ở cùng một chuỗi nặng có thể có sự khác nhau
về kiểu kết hợp với các gốc đường, từ đó sẽ tạo ra mức độ bổ sung cho tính chất
khác biệt phân tử của các KT. Chẳng hạn, cấu trúc đường của IgG khác với IgA và
IgD, cấu trúc đường của phân lớp IgA1 khác với IgA2. Sự thay đổi bất thường của
các gốc đường này sẽ gây ra một số bệnh tự miễn (autoimmune disease) hay biểu
hiện của bệnh ung thư [15],[47],[71].
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể
Hình 1.1. Cấu tạo chung của kháng thể.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiChức năng sinh học của phân tử KT trong hệ thống miễn dịch là nhận biết "cái
lạ" được gọi chung là kháng nguyên ngoại lai và tác động lên "cái lạ" đó[67].
Vùng V là vị trí của phân tử KT làm nhiệm vụ nhận biết "cái lạ" còn vùng C
làm nhiệm vụ tương tác với các phân tử, tế bào khác để hoàn thành một cách có
hiệu quả việc loại trừ yếu tố lạ.
1.1.3.1. Chức năng nhận biết kháng nguyên
Chức năng nhận biết của kháng thể được thực hiện thông qua việc phân tử KT
kết hợp đặc hiệu với nhóm quyết định kháng nguyên (epitop). Vị trí kết hợp nằm ở
vùng V của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, đầu tận cùng - NH2. Ở đó chuỗi polypeptide
được gấp lại và tạo ra cấu trúc nếp gấp, trong đó có những đoạn tương đối ổn định
xen giữa những vòng cực kì thay đổi. Những vòng này cụm sát lại gần nhau ở đầu
mút (tận cùng N) tạo ra một cái túi trong đó các phân tử nhỏ của nhóm quyết định
kháng nguyên có thể lọt khít vào.
Nhờ khả năng kết hợp đặc hiệu mà KT có thể tác động trực tiếp lên KN, ví dụ
như trường hợp trung hoà độc tố hoà tan do vi khuẩn tiết ra. Bằng cách kết hợp với
các quyết định KN nằm trong hay gần vị trí hoạt động của độc tố, các phân tử KT
phong bế phản ứng của độc tố với cơ thể. Sự kết hợp kháng thể với các quyết định
kháng nguyên sẽ làm thay đổi cấu hình không gian của độc tố, làm thay đổi hoạt tính
và độc tố không thể bám vào tế bào của tổ chức đích. Tác dụng trực tiếp cũng có thể
xảy ra khi 2 cánh tay Fab của phân tử KT tạo ra mạng lưới ngưng kết đối với vi
khuẩn, kí sinh trùng,… nhờ đó hạn chế khả năng gây bệnh của chúng.
1.1.3.2. Chức năng sinh học có hiệu quả thứ phát của kháng thể
Các chức năng sinh học có hiệu quả khác của KT được xem như chức năng
thứ phát, vì nó xảy ra sau khi domain V kết hợp đặc hiệu với KN. Các chức năng
này được thực hiện thông qua trung gian mảnh Fc của phân tử KT.
+ Chức năng hoạt hoá bổ thể: KT kết hợp đặc hiệu với KN hình thành phức
hợp KN- KT. Việc kết hợp với kháng nguyên đã làm thay đổi cấu hình không gian
của phân tử KT và bộc lộ vị trí kết hợp bổ thể. Khả năng hoạt hoá bổ thể chỉ có ở
IgG và IgM, nhưng không phải tất cả đều như nhau mà phụ thuộc vào cấu trúc của
mỗi loại.
+ Tương tác với các tế bào khác:
Phần Fc của KT có khả năng gắn vào thụ thể (receptor) trên bề mặt một số tế
bào như tế bào mast, bạch cầu ái kiềm, các đại thực bào và bạch cầu trung tính.Phần Fab của KT để nhận biết, kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên lạ, trên cơ sở
đó kháng nguyên bị bao vây, khu trú lại.
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo phân tử của các chuỗi nặng người ta phân ra làm 5
lớp KT: Chuỗi nặng gamma () cho IgG, chuỗi nặng alpha () cho IgA, chuỗi nặng
muy () cho IgM, chuỗi nặng delta () cho IgD, chuỗi nặng epsilon () cho IgE.
Bảng 1.1. Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người[15]
Các
KT
Các
lớp
phụ
Khối
lượng
phân tử
(kDa)
Nồng độ
trong huyết
thanh
(mg/100ml)
Chức năng sinh học
IgG
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
150-170 800-1700
Nhận biết virus, vi khuẩn độc tố.
Hoạt hoá bổ thể.
Liên kết với thụ thể
Qua màng nhau thai.
IgM
970, dạng
pentame
.
♂ : 50-250
♀ : 60-270
XuÊt hiÖn ®Çu tiªn sau khi kÝch thÝch KN.
Ng-ng kÕt hång cÇu, vi khuÈn, virus.
Liªn kÕt víi KN, ho¹t ho¸ bæ thÓ.
IgA
IgA1
IgA2
160
320 (dạng
dimer)
♂ : 100-400
♀ : 85-450
Chống lại vi khuẩn, virus, nguyên sinh
động vật nhờ có mặt ở tuyến nhầy.
Hoạt hoá bổ thể theo con đường xen kẽ.
Tham gia vào opsonin hoá khi phản ứng
với thụ thể
IgD 175 <10
Chủ yếu tìm thấy ở tế bào B, có thể khi tiếp
xúc với KN, truyền tín hiệu hoạt hoá tế bào B
IgE 190 <0,03
Tham gia phản ứng viêm dị ứng, quá mẫn
khi liên kết với tế bào mast.
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí
+ Biểu hiện bất thường thứ nhất là: Hàm lượng KT đơn dòng trong huyết
thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư. Các KT đơn dòng biểu hiện
thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thể là IgA (ví dụ bệnh đa u tuỷ xương dòng
IgA, bệnh ung thư cổ tử cung). Đôi khi sự tăng các KT đơn dòng cũng được thấy
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiđối với các lớp kháng thể IgD và IgE, nhưng rất hiếm. Đối với các dưới lớp IgG thì
các đơn dòng tăng ưu thế là IgG1> IgG2> IgG3> IgG4.
Biểu hiện tăng đơn dòng của các KT còn thấy rõ ở tính bất thường trong cấu
trúc của kháng thể. Đó là sự tổng hợp quá mức các mảnh protein chuỗi nhẹ dạng
dimer là protein Bence-Jones (BJP), có thể phát hiện được dễ dàng trong điện di lớp
mỏng agarose [15],[28].
+ Biểu hiện bất thường thứ hai là: Sự thay đổi cấu trúc đường của phân tử KT.
Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử KT trong bệnh ung thư (tăng sinh miễn dịch) cho
phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đường của các đơn vị dòng IgA và IgG. Bệnh
biểu hiện rõ nhất là chuỗi nặng (của IgA) đơn dòng có mức độ kết hợp đường rất
cao (glycosylation), nghĩa là ở chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đường. Hậu quả
của bệnh chuỗi nặng của IgA trong bệnh đa u tuỷ xương đã tạo ra sự đóng cặn
nhiều chuỗi nặng ở tiểu cầu thận, gây tổn thương thận nghiêm trọng. Sự thay đổi cấu
trúc đường của một số IgA, IgG làm biến đổi đặc tính ái lực hoá học của kháng thể
đối với một số hoạt chất tự nhiên, đặc biệt là các lectin có nguồn gốc từ động vật hoặc
thực vật. Đó là những nghiên cứu của Allen A.C. và các cộng sự [41] về sự thay đổi
cấu trúc đường của phân tử KT IgA1 trong bệnh viêm cầu thận.
Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgG trong bệnh đa u tuỷ xương cũng đã
được chứng minh. Trên phân tử IgG của bệnh nhân đa u tuỷ xương có gắn thêm 2
phân tử đường trên chuỗi nặng, nhưng thiếu hụt sialic acid và không có nhóm GlcNAc-1. Sự biến đổi các chuỗi đường này xảy ra ở protein Bence-Jones (BJP), bắt
nguồn từ phân tử IgG và ở cả các chuỗi nặng của IgA trong một số bệnh ung thư [41].
Như vậy, những biểu hiện của các kháng thể đơn dòng cũng có thể được sử
dụng để theo dõi tình trạng bệnh ung thư bằng các loại lectin gây ngưng kết đặc
hiệu đường đối với chúng, giúp cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau
cũng như các bệnh truyền nhiễm khác.
1.2. AFP VÀ UNG THƯ
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh
Năm 1963, Abelev G.I.[38] tìm thấy AFP ở chuột nhắt bị ung thư gan trong
thực nghiệm. Một năm sau, Tatarinov Y.S.[97] lần đầu tiên tìm thấy AFP ở bệnh
nhân ung thư gan và từ đó trở đi AFP trở thành một dấu ấn ung thư đầu tiên được
ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan. AFP người là một glycoprotein có
ĐỀ NGHỊ
1. Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm xét nghiệm kháng
thể IgA1 và IgG bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA.
2. Cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn nữa để có thể xác định
được độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và xác định tỷ lệ % liên kết giữa các dạng
AFP bệnh lí và AFP thai phụ đối với các isolectin ConG giúp cho việc chẩn đoán
bệnh chính xác.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2008
Chủ đề: Bệnh ung thư
Hóa sinh học
Kháng nguyên
Kháng thể
Lectin
Miêu tả: 114 tr. + CD-ROM + tóm tắt
Lựa chọn, tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít(Artocarpus heterophyllus lamk, Artocarpus masticata Gagn và Artocarpus champeden Gagn). Đồng thời xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loại đậu (Canavalia maritima Aublet và Canavilia gladiata Jacq D.C) để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng nhằm xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA1, IgG kháng nguyên AFP từ huyết thanh người bình thường và một số bệnh nhân ung thư gan, ung thư vòm họng, đa u tủy xương, viêm gan siêu vi trùng
Luận án TS. Hóa sinh học -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2008
CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ ........................................................................................ 3
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể.............................................................. 3
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể ............................................................ 4
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể ............................................................ 5
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí ..................................... 6
1.2. AFP và UNG THƯ .................................................................................................. 7
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh................ 7
1.2.2. Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP...................... 8
1.2.3. Chức năng của AFP.................................................................................... 9
1.2.4. Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính
và một số bệnh khác ................................................................................. 10
1.3 LECTIN ............................................................................................................... 11
1.3.1. Lược sử nghiên cứu lectin ......................................................................... 11
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới........................................................ 14
1.3.3. Một số tính chất lí hoá của lectin .............................................................. 15
1.3.4. Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin .................................... 18
1.3.5. Ứng dụng của lectin .................................................................................. 20
1.3.6. Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam.................................................. 24
Chương 2. NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 26
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2.1. NGUYÊN LIỆU..................................................................................................... 26
2.1.1. Hạt mít....................................................................................................... 26
2.1.2. Hạt đậu ...................................................................................................... 27
2.1.3. Huyết thanh, hồng cầu người .................................................................... 27
2.2. HOÁ CHẤT và THIẾT BỊ ....................................................................................... 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... 28
2.3.1. Xác định hoạt độ lectin.............................................................................. 28
2.3.2. Xác định hàm lượng protein...................................................................... 29
2.3.3. Tinh chế lectin ........................................................................................... 30
2.3.4. Điều chế các cột sắc kí ái lực .................................................................... 31
2.3.5. Tinh chế kháng thể .................................................................................... 32
2.3.6. Kỹ thuật ELISA......................................................................................... 33
2.3.7. Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting)..................................... 36
2.3.8. Kỹ thuật điện di ......................................................................................... 37
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN................................................................. 38
3.1. TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden
Gagn. và A. masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima
Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.)................ 38
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A. heterophyllus Lamk;
A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.) ............................................................... 38
3.1.2. Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet)........... 43
3.1.3. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ............. 50
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA1 TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI ......................................................................................................... 53
3.2.1. Tinh chế IgA1 bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo......................... 54
3.2.2. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA1 bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA ..... 59
3.2.3. Định lượng IgA1 trong HT người bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA........... 68
3.3. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI.................................................................................................... 703.3.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể IgG từ huyết thanh của ConM... 70
3.3.2. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bằng cột
ConM-Sepharose-4B tự tạo...................................................................... 72
3.3.3. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật
LECTIN- ELISA ...................................................................................... 77
3.3.4. Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG bằng kỹ thuật
LECTIN-ELISA........................................................................................ 85
3.4. ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ,
PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ
GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ..................................................... 87
3.4.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm
(Canavalia gladiata Jacq D.C.) .................................................................................. 87
3.4.2. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể trong huyết thanh của ConG
......................... 88
3.4.3. Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP bệnh lí ........ 89
3.5. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 91
KẾT LUẬN.... .................................................... .................................................96
ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................. 98
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ....................................................................................... 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 100
PHỤ LỤC....... ..................................................................................................... 110
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỞ ĐẦU
Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bình thường và của các bệnh nhân
nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh nhân ung thư rất đa dạng và phức tạp. Khả năng đáp
ứng miễn dịch của cơ thể được biểu hiện là sự tăng cường tổng hợp kháng thể hoặc
xuất hiện một số kháng nguyên chỉ thị bệnh đã được nhiều nhà khoa học Y học quan
tâm nghiên cứu. Mục đích của các nghiên cứu theo hướng này là xác định sự biểu
hiện bất thường của một số kháng thể và kháng nguyên chỉ thị bệnh nhằm chẩn đoán
bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời và hiệu quả.
Có rất nhiều phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng để nghiên
cứu sự thay đổi đáp ứng đó như: ELISA, RIA, DOT-BLOT, Western BLOT, các
kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết các kháng
nguyên bệnh hay nhận biết các kháng thể bệnh lí xuất hiện,... Kháng thể bệnh lí
xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt biểu
hiện bất thường về số lượng và chất lượng, chẳng hạn các kháng thể đã bị cải
biến sau tổng hợp như thoái hoá hay tăng khả năng glycosyl hoá (loại bỏ hoặc
gắn thêm các gốc đường), thậm chí có sự thay đổi thoái hoá đứt gãy cấu trúc hoá
học protein của phân tử (như mảnh peptide Bence-Jones chuỗi nhẹ ở bệnh ung
thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B)…Tất cả những thay đổi về đáp ứng miễn dịch
và hoá sinh cần được phân tích chính xác và bằng những kỹ thuật xét
nghiệm đặc hiệu để phát hiện sớm sự biểu hiện của bệnh.
Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài
nguyên sinh vật như động vật, thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát
hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888). Trong nhiều năm nghiên
cứu, các nhà khoa học đã chứng minh lectin có rất nhiều ứng dụng trong Y dược
học. Đặc biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự
tương tác đặc hiệu rất tinh vi của lectin với các kháng thể và kháng nguyên (do bản
chất hoá học của lectin là những protein liên kết đặc hiệu với các gốc đường của
nhiều loại kháng thể và kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu
sự biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên trong đáp ứng miễn dịch.Mục tiêu đề tài
Lựa chọn, tinh chế một số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với
kháng thể, kháng nguyên để xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA1, IgG và
kháng nguyên AFP từ huyết thanh của người bình thường, một số bệnh nhân: Ung
thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan và viêm gan siêu vi trùng.
Nội dung của đề tài
1. Tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít (Artocarpus heterophyllus Lamk;
Artocarpus masticata Gagn. và Artocarpus champeden Gagn.) của Việt Nam và sử
dụng jacalin để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgA1 từ huyết thanh
người.
2. Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loài đậu (Canavalia
maritima Aublet và Canavalia gladiata Jacq D.C.) của Việt Nam để thiết kế bộ sinh
phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người, phân biệt kháng nguyên AFP
(Alpha Feto Protein) của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
Những đóng góp mới của luận án
1. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam
(Canavalia maritima Aublet) có khả năng bắt giữ đặc hiệu với kháng thể IgG từ
huyết thanh người.
2. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia
gladiata Jacq D.C.) có khả năng bắt giữ và phân biệt được các loại kháng nguyên
AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
3. Bước đầu nghiên cứu tạo hai bộ sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA1,
IgG từ huyết thanh người và nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm trong thời
gian 4 tháng vẫn cho giá trị sử dụng.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển
Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) và đặc tính liên kết đặc hiệu giữa lectin
ConM với kháng thể IgG từ huyết thanh người.
2. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq
D.C.) và chứng minh được các isolectin ConG nhận biết riêng biệt 3 dạng kháng
nguyên AFP của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và của thai phụ.
3. Đã bước đầu thiết kế được 2 bộ sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA
và ConM-ELISA) để định lượng kháng thể IgA1 và IgG.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ
1.1.1. Khái niệm
Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, khi những tế bào bạch cầu của hệ
miễn dịch nhận thông tin được tiếp xúc với kháng nguyên (KN) sẽ sản xuất ra những
chất đặc hiệu chống lại KN ấy. Những chất đó được gọi là kháng thể (KT), hay
globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt là Ig). Loại KT thứ nhất được đổ vào
dịch nội môi, đó là KT dịch thể, loại KT này do tế bào plasma dạng biệt hoá sau cùng
của tế bào B sản xuất. Loại KT thứ hai nằm ngay trên màng của những tế bào B sinh
ra nó, đó là KT màng tế bào và đóng vai trò thụ thể của những tế bào này. Phản ứng
kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu hoá học cao. Ở người có 5 lớp kháng
thể là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE [1].
Hàm lượng các lớp kháng thể trong hệ thống dịch thể của cơ thể phụ thuộc
vào trạng thái sinh lí, tuổi, giới tính, điều kiện địa lí. Ngoài ra còn có một số mối
quan hệ về số lượng và chất lượng của các KT đối với sự biểu hiện bệnh lí như: Một
số bệnh ung thư, nhiễm trùng và một số bệnh tự miễn. Trong huyết thanh, thành
phần kháng thể chiếm khoảng 20% tổng lượng protein. Ngày nay nhờ những tiến bộ
trong lĩnh vực sinh học phân tử, người ta đã hiểu ngày càng sâu và đầy đủ về cấu
trúc, chức năng của các phân tử KT [15],[35].
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể
Tất cả các KT đều có bản chất là glycoprotein, mỗi phân tử đều có 2 chuỗi nhẹ
và 2 chuỗi nặng [36].
* Hai chuỗi nhẹ (ngắn) kí hiệu là chuỗi L (light chain) có khối lượng phân tử
khoảng 25-28 kDa, mỗi chuỗi có khoảng 221- 312 amino acid. Chuỗi L gồm 2 loại
là hay .
................ Chuỗi nhẹ được hình thành từ hai vùng khu vực là khu vực không
biến đổi (C hay C ) và khu vực dễ biến đổi (V và V):
- Vùng không biến đổi có các gốc amino acid từ vị trí 108 đến tận cùng C, rất
ít thay đổi về thành phần và trật tự sắp xếp các amino acid.
- Vùng biến đổi có thứ tự amino acid từ vị trí 107 đến tận cùng N của chuỗi
polypeptide.* Hai chuỗi nặng (dài) được kí hiệu là chuỗi H (heavy chain), mang tính chất
đặc trưng riêng của từng lớp KT. Khối lượng phân tử khoảng 50-57 kDa, mỗi chuỗi
chứa 440 - 460 amino acid. Chuỗi nặng gồm khu vực N tận cùng dễ biến đổi (VH)
và 3 khu vực không biến đổi CH (đối với IgD, IgG và IgA) hay 4 khu vực không
biến đổi (đối với IgM và IgE). Khu vực không biến đổi của chuỗi nặng kí hiệu là
CH. Mỗi một khu vực biến đổi gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable), còn gọi là các
vùng xác định bổ sung (CDR). Các paratop được hình thành từ những vị trí đặt kề
nhau trong khoảng không của các vùng siêu biến được tách biệt nhau bằng hai vùng
bảo thủ hơn (hay các vùng khuôn). Vùng nằm giữa hai khu vực CH1 và CH2 của
chuỗi H được gọi là vùng khớp hay vùng bản lề, đảm bảo cho tính mềm dẻo của các
phân tử KT, đồng thời hai cánh tay (VL, CL,VH, CH1) của phân tử có thể di động
trong không gian.
Các chuỗi nặng của KT luôn luôn được kết hợp với các gốc đường ở các vị trí
khác nhau. Nhìn chung, các gốc đường kết hợp với KT là các oligosaccharide có
chứa một hay nhiều gốc sialic acid. Ở cùng một chuỗi nặng có thể có sự khác nhau
về kiểu kết hợp với các gốc đường, từ đó sẽ tạo ra mức độ bổ sung cho tính chất
khác biệt phân tử của các KT. Chẳng hạn, cấu trúc đường của IgG khác với IgA và
IgD, cấu trúc đường của phân lớp IgA1 khác với IgA2. Sự thay đổi bất thường của
các gốc đường này sẽ gây ra một số bệnh tự miễn (autoimmune disease) hay biểu
hiện của bệnh ung thư [15],[47],[71].
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể
Hình 1.1. Cấu tạo chung của kháng thể.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiChức năng sinh học của phân tử KT trong hệ thống miễn dịch là nhận biết "cái
lạ" được gọi chung là kháng nguyên ngoại lai và tác động lên "cái lạ" đó[67].
Vùng V là vị trí của phân tử KT làm nhiệm vụ nhận biết "cái lạ" còn vùng C
làm nhiệm vụ tương tác với các phân tử, tế bào khác để hoàn thành một cách có
hiệu quả việc loại trừ yếu tố lạ.
1.1.3.1. Chức năng nhận biết kháng nguyên
Chức năng nhận biết của kháng thể được thực hiện thông qua việc phân tử KT
kết hợp đặc hiệu với nhóm quyết định kháng nguyên (epitop). Vị trí kết hợp nằm ở
vùng V của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, đầu tận cùng - NH2. Ở đó chuỗi polypeptide
được gấp lại và tạo ra cấu trúc nếp gấp, trong đó có những đoạn tương đối ổn định
xen giữa những vòng cực kì thay đổi. Những vòng này cụm sát lại gần nhau ở đầu
mút (tận cùng N) tạo ra một cái túi trong đó các phân tử nhỏ của nhóm quyết định
kháng nguyên có thể lọt khít vào.
Nhờ khả năng kết hợp đặc hiệu mà KT có thể tác động trực tiếp lên KN, ví dụ
như trường hợp trung hoà độc tố hoà tan do vi khuẩn tiết ra. Bằng cách kết hợp với
các quyết định KN nằm trong hay gần vị trí hoạt động của độc tố, các phân tử KT
phong bế phản ứng của độc tố với cơ thể. Sự kết hợp kháng thể với các quyết định
kháng nguyên sẽ làm thay đổi cấu hình không gian của độc tố, làm thay đổi hoạt tính
và độc tố không thể bám vào tế bào của tổ chức đích. Tác dụng trực tiếp cũng có thể
xảy ra khi 2 cánh tay Fab của phân tử KT tạo ra mạng lưới ngưng kết đối với vi
khuẩn, kí sinh trùng,… nhờ đó hạn chế khả năng gây bệnh của chúng.
1.1.3.2. Chức năng sinh học có hiệu quả thứ phát của kháng thể
Các chức năng sinh học có hiệu quả khác của KT được xem như chức năng
thứ phát, vì nó xảy ra sau khi domain V kết hợp đặc hiệu với KN. Các chức năng
này được thực hiện thông qua trung gian mảnh Fc của phân tử KT.
+ Chức năng hoạt hoá bổ thể: KT kết hợp đặc hiệu với KN hình thành phức
hợp KN- KT. Việc kết hợp với kháng nguyên đã làm thay đổi cấu hình không gian
của phân tử KT và bộc lộ vị trí kết hợp bổ thể. Khả năng hoạt hoá bổ thể chỉ có ở
IgG và IgM, nhưng không phải tất cả đều như nhau mà phụ thuộc vào cấu trúc của
mỗi loại.
+ Tương tác với các tế bào khác:
Phần Fc của KT có khả năng gắn vào thụ thể (receptor) trên bề mặt một số tế
bào như tế bào mast, bạch cầu ái kiềm, các đại thực bào và bạch cầu trung tính.Phần Fab của KT để nhận biết, kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên lạ, trên cơ sở
đó kháng nguyên bị bao vây, khu trú lại.
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo phân tử của các chuỗi nặng người ta phân ra làm 5
lớp KT: Chuỗi nặng gamma () cho IgG, chuỗi nặng alpha () cho IgA, chuỗi nặng
muy () cho IgM, chuỗi nặng delta () cho IgD, chuỗi nặng epsilon () cho IgE.
Bảng 1.1. Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người[15]
Các
KT
Các
lớp
phụ
Khối
lượng
phân tử
(kDa)
Nồng độ
trong huyết
thanh
(mg/100ml)
Chức năng sinh học
IgG
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
150-170 800-1700
Nhận biết virus, vi khuẩn độc tố.
Hoạt hoá bổ thể.
Liên kết với thụ thể
Qua màng nhau thai.
IgM
970, dạng
pentame
.
♂ : 50-250
♀ : 60-270
XuÊt hiÖn ®Çu tiªn sau khi kÝch thÝch KN.
Ng-ng kÕt hång cÇu, vi khuÈn, virus.
Liªn kÕt víi KN, ho¹t ho¸ bæ thÓ.
IgA
IgA1
IgA2
160
320 (dạng
dimer)
♂ : 100-400
♀ : 85-450
Chống lại vi khuẩn, virus, nguyên sinh
động vật nhờ có mặt ở tuyến nhầy.
Hoạt hoá bổ thể theo con đường xen kẽ.
Tham gia vào opsonin hoá khi phản ứng
với thụ thể
IgD 175 <10
Chủ yếu tìm thấy ở tế bào B, có thể khi tiếp
xúc với KN, truyền tín hiệu hoạt hoá tế bào B
IgE 190 <0,03
Tham gia phản ứng viêm dị ứng, quá mẫn
khi liên kết với tế bào mast.
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí
+ Biểu hiện bất thường thứ nhất là: Hàm lượng KT đơn dòng trong huyết
thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư. Các KT đơn dòng biểu hiện
thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thể là IgA (ví dụ bệnh đa u tuỷ xương dòng
IgA, bệnh ung thư cổ tử cung). Đôi khi sự tăng các KT đơn dòng cũng được thấy
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiđối với các lớp kháng thể IgD và IgE, nhưng rất hiếm. Đối với các dưới lớp IgG thì
các đơn dòng tăng ưu thế là IgG1> IgG2> IgG3> IgG4.
Biểu hiện tăng đơn dòng của các KT còn thấy rõ ở tính bất thường trong cấu
trúc của kháng thể. Đó là sự tổng hợp quá mức các mảnh protein chuỗi nhẹ dạng
dimer là protein Bence-Jones (BJP), có thể phát hiện được dễ dàng trong điện di lớp
mỏng agarose [15],[28].
+ Biểu hiện bất thường thứ hai là: Sự thay đổi cấu trúc đường của phân tử KT.
Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử KT trong bệnh ung thư (tăng sinh miễn dịch) cho
phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đường của các đơn vị dòng IgA và IgG. Bệnh
biểu hiện rõ nhất là chuỗi nặng (của IgA) đơn dòng có mức độ kết hợp đường rất
cao (glycosylation), nghĩa là ở chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đường. Hậu quả
của bệnh chuỗi nặng của IgA trong bệnh đa u tuỷ xương đã tạo ra sự đóng cặn
nhiều chuỗi nặng ở tiểu cầu thận, gây tổn thương thận nghiêm trọng. Sự thay đổi cấu
trúc đường của một số IgA, IgG làm biến đổi đặc tính ái lực hoá học của kháng thể
đối với một số hoạt chất tự nhiên, đặc biệt là các lectin có nguồn gốc từ động vật hoặc
thực vật. Đó là những nghiên cứu của Allen A.C. và các cộng sự [41] về sự thay đổi
cấu trúc đường của phân tử KT IgA1 trong bệnh viêm cầu thận.
Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgG trong bệnh đa u tuỷ xương cũng đã
được chứng minh. Trên phân tử IgG của bệnh nhân đa u tuỷ xương có gắn thêm 2
phân tử đường trên chuỗi nặng, nhưng thiếu hụt sialic acid và không có nhóm GlcNAc-1. Sự biến đổi các chuỗi đường này xảy ra ở protein Bence-Jones (BJP), bắt
nguồn từ phân tử IgG và ở cả các chuỗi nặng của IgA trong một số bệnh ung thư [41].
Như vậy, những biểu hiện của các kháng thể đơn dòng cũng có thể được sử
dụng để theo dõi tình trạng bệnh ung thư bằng các loại lectin gây ngưng kết đặc
hiệu đường đối với chúng, giúp cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau
cũng như các bệnh truyền nhiễm khác.
1.2. AFP VÀ UNG THƯ
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh
Năm 1963, Abelev G.I.[38] tìm thấy AFP ở chuột nhắt bị ung thư gan trong
thực nghiệm. Một năm sau, Tatarinov Y.S.[97] lần đầu tiên tìm thấy AFP ở bệnh
nhân ung thư gan và từ đó trở đi AFP trở thành một dấu ấn ung thư đầu tiên được
ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan. AFP người là một glycoprotein có
ĐỀ NGHỊ
1. Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm xét nghiệm kháng
thể IgA1 và IgG bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA.
2. Cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn nữa để có thể xác định
được độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và xác định tỷ lệ % liên kết giữa các dạng
AFP bệnh lí và AFP thai phụ đối với các isolectin ConG giúp cho việc chẩn đoán
bệnh chính xác.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: