LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến thực phẩm
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích và yêu cầu ............................................................................................2 1.2.1. Mục đích............................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu..............................................................................................................2 Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3 2.1. Nấm Linh Chi.......................................................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Linh Chi .............................................................3 2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố...........................................................................4 2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học ...................................................................4 2.1.4. Tác dụng của nấm Linh Chi ..............................................................................8 2.2. Giới thiệu về triterpenoid ...................................................................................11 2.2.1. Định nghĩa .......................................................................................................11 2.2.2. Cấu trúc của triterpenoid.................................................................................11 2.2.3. Đặcđiểmcủatriterpenoid..............................................................................12 2.2.4. Vaitròcủatriterpenoid..................................................................................13 2.3.Ứng dụng của triterpenoid ..................................................................................15 2.4. Trích ly và thu nhận ...........................................................................................16 2.4.1. Cơ sở khoa học duy trì và trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi ...........16 2.4.2. Phương pháp trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi...................................17 2.5. Tình hình sản xuất và nghiên cứu Linh Chi trong nước và trên thế giới ...........17 2.5.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi trên thế giới .......................17 2.5.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi tại Việt Nam ......................19 Phần III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........21 3.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ........................................................21 3.1.1. Đối tượng ........................................................................................................21 3.1.2. Thiết bị và hóa chất .........................................................................................21 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................21 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................21 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................21
3.3. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................21 3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly...........21 3.3.2. Xác định các thông số của quá trình trích ly...................................................21 3.3.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi ......................................22 3.3.4. Quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm Linh Chi ............................22 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................23 3.4.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý............................................................23 3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................25 3.4.3. Quá trình thu nhận triterpenoid nấm Linh Chi trong nấm Linh Chi...............29 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................29 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................30 4.1. Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................30 4.2.1. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................31 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................32 4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................34 4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................35 4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................37 4.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly
đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi................................38 4.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi .........................................39 4.4. Quy trình thu chế phẩm triterpenoid ..................................................................40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................42 5.1. Kết luận ..............................................................................................................42 5.2. Kiến nghị............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................43
1
Phần I MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
“Sống khoẻ - không bệnh tật” là niềm ước ao của con người ở bất cứ thời đại
nào. Tuy nhiên, sức khỏe của mỗi người còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, môi trường sống, dinh dưỡng và phòng bệnh. Trong đó dinh dưỡng để phòng ngừa bệnh tật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe. Vì thế con người ngày càng quan tâm hơn tới những thực phẩm không chỉ giàu dinh dưỡng mà còn có tác dụng như thuốc để tăng cường thể lực, phòng và điều trị bệnh tật, kéo dài tuổi thọ. Đó là những thực phẩm có thành phần dinh dưỡng đặc hiệu đối với cơ thể, có tác dụng tăng cường đề kháng và giúp cơ thể phòng bệnh. Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong dân gian, loài người đã sử dụng nhiều loại thuốc, từ dạng sơ chế đến tinh chế, cô đặc, hay chiết xuất từ các loại thảo dược có sẵn trong tự nhiên để điều trị bệnh. Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,... Trong đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á, vì nấm Linh Chi có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu.
Trung Quốc là một quốc gia có lịch sử phát triển lâu đời, đồng thời đây là nợi tạo ra các bài thuốc cổ truyền nổi tiếng trên thế giới. Ở Trung Quốc, Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc, các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh Chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm. Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.
Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: Ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh, ngăn chặn quá trình làm lão hoá,... và còn được sử dụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng bổ dưỡng, điều hoà huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi
2
thọ,...Tác dụng của Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng dược” trị được bách bệnh. Những nghiên cứu gần đây cho thấy Linh chi còn có khả năng giải độc chì, điều hòa huyết áp, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu...
Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm Linh Chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide... Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid. Tuy nhiên, trên thị trường, các sản phẩm từ Linh Chi hầu hết đều nhập ngoại từ Trung Quốc, Hàn Quốc có giá thành cao, một số còn chưa đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
Mặt khác, tại Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa, nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, lực lượng lao động đông đảo và nấm Linh Chi sản xuất ra chủ yếu chỉ bán dưới dạng nguyên liệu thô, giá trị kinh tế còn chưa cao, các cơ sở chế biến nấm Linh Chi còn hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học triterpenoid và ứng dụng cho chế biến thực phẩm từ nấm Linh Chi đạt tiêu chuẩn chất lượng có thể mang đến nhiều lợi ích to lớn.
Từ những thực nghiệm trên tui tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến thực phẩm”. 1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm Linh Chi và ứng dụng cho chế biến thực phẩm.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Xác định ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Xác định được quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm triterpenoid trong nấm Linh Chi.
3
Phần II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm Linh Chi
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Linh Chi * Nguồn gốc
Linh Chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, là loại nấm thuộc họ đa khổng (polyporaceae), thường mọc trên những thân cây mục. Người ta còn gọi Linh Chi là Linh Chi thảo, nhiều tác giả đã cho rằng đây là một loại cây cỏ nhưng thực ra Linh Chi là một loại nấm. Năm 1971, hai nhà bác học người Nhật là Yukio Naoi và Zenzabuno Kasai, giáo sư của phân khoa nông nghiệp, trường Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới sản xuất được loại nấm này một cách quy mô. Từ đó Linh Chi được trồng và sử dụng trong việc bào chế chứ không chỉ là huyền thoại [14,13,18].
* Phân loại
Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay [9,7].
Ngành: Eumycota
Ngành phụ: Basidiamyctina Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Aphyllophorales
Họ: Ganodermataceae
Họ phụ: Ganodermoidae Chi: Amauroderma
Cổ Linh Chi (Ganoderma applanatum (Pers Past), là các loài nấm gỗ không cuống (hay cuống rất ngắn) có nhiều tầng (mỗi năm thụ tầng lại phát triển thêm một lớp mới chồng lên). Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, mặt trên sù sì thô ráp. Nấm rất cứng (cứng như gỗ lim nên còn gọi là nấm lim).
Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh Chi và Linh Chi [7,6].
Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh Chi. Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùng làm thuốc
4
như Xích Linh Chi, Tử Linh Chi, Hắc Linh Chi [4, 2].
Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của
Trung Quốc đã phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại:
- Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc.
- Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc. - Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngot, tính bình, không độc.
- Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc.
- Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, không độc.
- Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc.
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Nấm Linh Chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh trên
các cây gỗ lâu năm, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Ngoài ra còn gặp chúng trên các cây Lim, Phượng Vĩ, So Đũa và một số loài cây chết, mục hay cả trên cây sống như Xoài, Mít, Mãng Cầu... Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [1].
Linh Chi có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hay rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hay đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành.
Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hay ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hay nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni. Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm.
Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt hay trắng. Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [2].
2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase.
5
Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gồm các chất: Nước(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi... Hai nguyên tố quan trọng nhất là Selenium và Germanium.
Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi. Theo nhiều tài liệu các hoạt chất được thể hiện dưới các nhóm chính sau [5].
Hình 2.1. Công thức phân tử các hoạt chất sinh học của nấm Linh Chi a. Nhóm nucleoside
Nhóm này đặc trưng bởi dẫn xuất của adenosine với tác dụng hỗ trợ thư giãn cơ, giảm đau và ức chế sự dính kết tiểu cầu.
b. Nhóm có bản chất proteine
Nhóm này nổi bật với Lingzhi - 8 do các nhà khoa học Nhật Bản tìm ra được chứng minh là một tác nhân hỗ trợ chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch rất hữu hiệu. Đồng thời, duy trì tạo kháng thể hỗ trợ chống các kháng nguyên viêm gan B [21].
c. Nhóm Steroide
Nhóm Steroide khá phong phú ở các nấm Linh Chi với tác dụng chủ đạo là ức chế sinh tổng hợp cholesterol bởi các lacton A, B và các sterol.
d. Nhóm alcaloide
Nhóm alcaloide còn ít được khảo cứu. Tuy nhiên nó có tác dụng trợ tim là rõ ràng. e. Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu Triterpen
Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu triterpen được phát hiện ngày một nhiều, năm 1986, Arisawa, M.và cộng sự đã xác định cấu trúc:
- Ganodermenonol: 26 - hydroxy - 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - one.
6
- Ganodermadiol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26 - diol.
- Ganodermatriol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26,27 - triol. Trong các nhóm Ganoderic acid, Wang và cộng sự đã chứng minh được hiệu
lực ức chế kết tụ cầu ở người và xác định cấu trúc phân tử của Ganoderic acid S: Lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta, 15 alpha - diacetoxy - 26 - oic acid. Kết quả gắn đồng vị phóng xạ P- 32 chỉ ra rằng Ganodermic acid hoạt hoá sự thuỷ phân P1P2 (đó là phosphatidylinositol 4,5 - biphosphate).
f. Nhóm các ester với axít béo không no linoleic
Nhóm các ester với axít béo không no linoleic được ghi nhận vào năm 1991
có hoạt tính chống ung thư. Đó là 2 ergosterol mới:
- Steryl ester1: Ergosta - 7.22 - dien - 3beta - yl – linoleate
- Steryl ester 2: 5 alpha. 8 alpha - epidioxyergosta - 6.22 - dien - 3 beta - yl - linoleate. Đồng thời các tác giả còn tìm ra 1 lanostanoid và 1 steroid mới cũng có tác
dụng ức chế các tế bào ung thư [4, 5]. g. Nhóm Polysaccharide
Có trên 200 loại polyssaccharide được trích ly và thu nhận từ nấm Linh Chi. Theo Hee và cộng sự năm 1992, đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polysaccharide có hoạt tính làm tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycosid [18].
h. Các phức hợp Polysaccharide-proteine
Đặc biệt các phức hợp Polysaccharide-proteine có hoạt tính hỗ trợ chống khối u và tăng miễn dịch đã được chỉ ra từ lâu. Gần đây tác dụng tăng sinh tổng hợp IL-2 (Interleukine-2) và hoạt tính DNA polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharit đã soi sáng thêm khả năng trẻ hoá, tăng tuổi thọ bởi các nấm Linh Chi [31].
Hàng loạt các nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước của các tác giả Nhật Bản và Trung Quốc chứng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ rệt, thậm chí tan khối u với tỷ lệ 3/4 với các loài G.applantum và G. Lucidum [8]. Những tổng kết xác đáng về vai trò sinh dược học của các nhóm hoạt chất này được R. Chang giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh năm 1991 với các báo cáo thực nghiệm của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc và Hoa Kỳ.
i. Nhóm triterpenoid
Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoid - các axít ganoderic. Những năm 1984 -1987, lần đầu tiên Nishitiba và cộng sự đã
7
chứng minh ganoderic acid C là chất mới trong tự nhiên. Sau đó Morigiwa (1986) tìm ra thêm ganoderic acid B. Năm 2001, Masao Hattori đã trích ly thêm được 10 triterpennoid mới bao gồm lucidumol A và B, các ganoderic A, B, E, F, H, K, Y và R. Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoid - các axít ganoderic.
Bảng 2.1. Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi và công dụng[5]
Nấm Linh Chi với các kích thước trên được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tui cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC
- Sử dụng dung môi là etanol 90%
- Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định
triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được kích thước nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi. Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng , vì dung môi để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất để lựa chọn dung môi. Được biết các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi có cả chất phân cực và không phân cực, một số chất tan trong nước, một số ít không tan trong nước mà tan trong các dung môi như methanol [16, 17], ethanol [25] và ethyl acetate [13]. Chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, ngoài yếu tố hoà tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn phải lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm. Do đó, chúng tui chọn nước là dung môi cho quá trình trích ly nấm Linh Chi và sử dụng dung môi
này cho các nghiên cứu tiếp theo.
Dung môi : Methanol 90%; Ethanol 90%; Ethyl acetate 90% - Khối lượng mẫu: 2g
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a
- Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến thực phẩm
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 1.2. Mục đích và yêu cầu ............................................................................................2 1.2.1. Mục đích............................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu..............................................................................................................2 Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3 2.1. Nấm Linh Chi.......................................................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Linh Chi .............................................................3 2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố...........................................................................4 2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học ...................................................................4 2.1.4. Tác dụng của nấm Linh Chi ..............................................................................8 2.2. Giới thiệu về triterpenoid ...................................................................................11 2.2.1. Định nghĩa .......................................................................................................11 2.2.2. Cấu trúc của triterpenoid.................................................................................11 2.2.3. Đặcđiểmcủatriterpenoid..............................................................................12 2.2.4. Vaitròcủatriterpenoid..................................................................................13 2.3.Ứng dụng của triterpenoid ..................................................................................15 2.4. Trích ly và thu nhận ...........................................................................................16 2.4.1. Cơ sở khoa học duy trì và trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi ...........16 2.4.2. Phương pháp trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi...................................17 2.5. Tình hình sản xuất và nghiên cứu Linh Chi trong nước và trên thế giới ...........17 2.5.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi trên thế giới .......................17 2.5.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi tại Việt Nam ......................19 Phần III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........21 3.1. Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ........................................................21 3.1.1. Đối tượng ........................................................................................................21 3.1.2. Thiết bị và hóa chất .........................................................................................21 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................21 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................21 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................21
3.3. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................21 3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly...........21 3.3.2. Xác định các thông số của quá trình trích ly...................................................21 3.3.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi ......................................22 3.3.4. Quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm Linh Chi ............................22 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................23 3.4.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý............................................................23 3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................25 3.4.3. Quá trình thu nhận triterpenoid nấm Linh Chi trong nấm Linh Chi...............29 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................29 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................30 4.1. Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................30 4.2.1. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................31 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................32 4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................34 4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................35 4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly triterpenoid
trong nấm Linh Chi .....................................................................................37 4.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly
đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi................................38 4.3. Quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi .........................................39 4.4. Quy trình thu chế phẩm triterpenoid ..................................................................40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................42 5.1. Kết luận ..............................................................................................................42 5.2. Kiến nghị............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................43
1
Phần I MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
“Sống khoẻ - không bệnh tật” là niềm ước ao của con người ở bất cứ thời đại
nào. Tuy nhiên, sức khỏe của mỗi người còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, môi trường sống, dinh dưỡng và phòng bệnh. Trong đó dinh dưỡng để phòng ngừa bệnh tật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe. Vì thế con người ngày càng quan tâm hơn tới những thực phẩm không chỉ giàu dinh dưỡng mà còn có tác dụng như thuốc để tăng cường thể lực, phòng và điều trị bệnh tật, kéo dài tuổi thọ. Đó là những thực phẩm có thành phần dinh dưỡng đặc hiệu đối với cơ thể, có tác dụng tăng cường đề kháng và giúp cơ thể phòng bệnh. Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong dân gian, loài người đã sử dụng nhiều loại thuốc, từ dạng sơ chế đến tinh chế, cô đặc, hay chiết xuất từ các loại thảo dược có sẵn trong tự nhiên để điều trị bệnh. Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,... Trong đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á, vì nấm Linh Chi có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu.
Trung Quốc là một quốc gia có lịch sử phát triển lâu đời, đồng thời đây là nợi tạo ra các bài thuốc cổ truyền nổi tiếng trên thế giới. Ở Trung Quốc, Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc, các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh Chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm. Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.
Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: Ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh, ngăn chặn quá trình làm lão hoá,... và còn được sử dụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng bổ dưỡng, điều hoà huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi
2
thọ,...Tác dụng của Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng dược” trị được bách bệnh. Những nghiên cứu gần đây cho thấy Linh chi còn có khả năng giải độc chì, điều hòa huyết áp, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu...
Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm Linh Chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide... Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid. Tuy nhiên, trên thị trường, các sản phẩm từ Linh Chi hầu hết đều nhập ngoại từ Trung Quốc, Hàn Quốc có giá thành cao, một số còn chưa đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
Mặt khác, tại Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa, nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, lực lượng lao động đông đảo và nấm Linh Chi sản xuất ra chủ yếu chỉ bán dưới dạng nguyên liệu thô, giá trị kinh tế còn chưa cao, các cơ sở chế biến nấm Linh Chi còn hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học triterpenoid và ứng dụng cho chế biến thực phẩm từ nấm Linh Chi đạt tiêu chuẩn chất lượng có thể mang đến nhiều lợi ích to lớn.
Từ những thực nghiệm trên tui tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến thực phẩm”. 1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ trích ly triterpenoid từ nấm Linh Chi và ứng dụng cho chế biến thực phẩm.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định ảnh hưởng của các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Xác định ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Xác định được quá trình thu nhận triterpenoid trong nấm Linh Chi.
- Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm triterpenoid trong nấm Linh Chi.
3
Phần II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm Linh Chi
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại nấm Linh Chi * Nguồn gốc
Linh Chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, là loại nấm thuộc họ đa khổng (polyporaceae), thường mọc trên những thân cây mục. Người ta còn gọi Linh Chi là Linh Chi thảo, nhiều tác giả đã cho rằng đây là một loại cây cỏ nhưng thực ra Linh Chi là một loại nấm. Năm 1971, hai nhà bác học người Nhật là Yukio Naoi và Zenzabuno Kasai, giáo sư của phân khoa nông nghiệp, trường Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới sản xuất được loại nấm này một cách quy mô. Từ đó Linh Chi được trồng và sử dụng trong việc bào chế chứ không chỉ là huyền thoại [14,13,18].
* Phân loại
Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay [9,7].
Ngành: Eumycota
Ngành phụ: Basidiamyctina Lớp: Hymenomycetes
Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Aphyllophorales
Họ: Ganodermataceae
Họ phụ: Ganodermoidae Chi: Amauroderma
Cổ Linh Chi (Ganoderma applanatum (Pers Past), là các loài nấm gỗ không cuống (hay cuống rất ngắn) có nhiều tầng (mỗi năm thụ tầng lại phát triển thêm một lớp mới chồng lên). Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, mặt trên sù sì thô ráp. Nấm rất cứng (cứng như gỗ lim nên còn gọi là nấm lim).
Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh Chi và Linh Chi [7,6].
Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh Chi. Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùng làm thuốc
4
như Xích Linh Chi, Tử Linh Chi, Hắc Linh Chi [4, 2].
Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của
Trung Quốc đã phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại:
- Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc.
- Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc. - Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngot, tính bình, không độc.
- Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc.
- Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, không độc.
- Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc.
2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Nấm Linh Chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh trên
các cây gỗ lâu năm, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Ngoài ra còn gặp chúng trên các cây Lim, Phượng Vĩ, So Đũa và một số loài cây chết, mục hay cả trên cây sống như Xoài, Mít, Mãng Cầu... Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [1].
Linh Chi có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hay rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hay đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành.
Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hay ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hay nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni. Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm.
Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt hay trắng. Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [2].
2.1.3. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi
Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase.
5
Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gồm các chất: Nước(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi... Hai nguyên tố quan trọng nhất là Selenium và Germanium.
Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi. Theo nhiều tài liệu các hoạt chất được thể hiện dưới các nhóm chính sau [5].
Hình 2.1. Công thức phân tử các hoạt chất sinh học của nấm Linh Chi a. Nhóm nucleoside
Nhóm này đặc trưng bởi dẫn xuất của adenosine với tác dụng hỗ trợ thư giãn cơ, giảm đau và ức chế sự dính kết tiểu cầu.
b. Nhóm có bản chất proteine
Nhóm này nổi bật với Lingzhi - 8 do các nhà khoa học Nhật Bản tìm ra được chứng minh là một tác nhân hỗ trợ chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch rất hữu hiệu. Đồng thời, duy trì tạo kháng thể hỗ trợ chống các kháng nguyên viêm gan B [21].
c. Nhóm Steroide
Nhóm Steroide khá phong phú ở các nấm Linh Chi với tác dụng chủ đạo là ức chế sinh tổng hợp cholesterol bởi các lacton A, B và các sterol.
d. Nhóm alcaloide
Nhóm alcaloide còn ít được khảo cứu. Tuy nhiên nó có tác dụng trợ tim là rõ ràng. e. Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu Triterpen
Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu triterpen được phát hiện ngày một nhiều, năm 1986, Arisawa, M.và cộng sự đã xác định cấu trúc:
- Ganodermenonol: 26 - hydroxy - 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - one.
6
- Ganodermadiol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26 - diol.
- Ganodermatriol: 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26,27 - triol. Trong các nhóm Ganoderic acid, Wang và cộng sự đã chứng minh được hiệu
lực ức chế kết tụ cầu ở người và xác định cấu trúc phân tử của Ganoderic acid S: Lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta, 15 alpha - diacetoxy - 26 - oic acid. Kết quả gắn đồng vị phóng xạ P- 32 chỉ ra rằng Ganodermic acid hoạt hoá sự thuỷ phân P1P2 (đó là phosphatidylinositol 4,5 - biphosphate).
f. Nhóm các ester với axít béo không no linoleic
Nhóm các ester với axít béo không no linoleic được ghi nhận vào năm 1991
có hoạt tính chống ung thư. Đó là 2 ergosterol mới:
- Steryl ester1: Ergosta - 7.22 - dien - 3beta - yl – linoleate
- Steryl ester 2: 5 alpha. 8 alpha - epidioxyergosta - 6.22 - dien - 3 beta - yl - linoleate. Đồng thời các tác giả còn tìm ra 1 lanostanoid và 1 steroid mới cũng có tác
dụng ức chế các tế bào ung thư [4, 5]. g. Nhóm Polysaccharide
Có trên 200 loại polyssaccharide được trích ly và thu nhận từ nấm Linh Chi. Theo Hee và cộng sự năm 1992, đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polysaccharide có hoạt tính làm tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycosid [18].
h. Các phức hợp Polysaccharide-proteine
Đặc biệt các phức hợp Polysaccharide-proteine có hoạt tính hỗ trợ chống khối u và tăng miễn dịch đã được chỉ ra từ lâu. Gần đây tác dụng tăng sinh tổng hợp IL-2 (Interleukine-2) và hoạt tính DNA polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharit đã soi sáng thêm khả năng trẻ hoá, tăng tuổi thọ bởi các nấm Linh Chi [31].
Hàng loạt các nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước của các tác giả Nhật Bản và Trung Quốc chứng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ rệt, thậm chí tan khối u với tỷ lệ 3/4 với các loài G.applantum và G. Lucidum [8]. Những tổng kết xác đáng về vai trò sinh dược học của các nhóm hoạt chất này được R. Chang giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh năm 1991 với các báo cáo thực nghiệm của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc và Hoa Kỳ.
i. Nhóm triterpenoid
Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoid - các axít ganoderic. Những năm 1984 -1987, lần đầu tiên Nishitiba và cộng sự đã
7
chứng minh ganoderic acid C là chất mới trong tự nhiên. Sau đó Morigiwa (1986) tìm ra thêm ganoderic acid B. Năm 2001, Masao Hattori đã trích ly thêm được 10 triterpennoid mới bao gồm lucidumol A và B, các ganoderic A, B, E, F, H, K, Y và R. Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoid - các axít ganoderic.
Bảng 2.1. Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi và công dụng[5]
Nấm Linh Chi với các kích thước trên được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tui cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 2g
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC
- Sử dụng dung môi là etanol 90%
- Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là: 1/20
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD để xác định
triterpenoid. Thí nghiệm này xác định được kích thước nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số trích ly đến hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi.
a. Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu quả trích ly triterpenoid trong nấm Linh Chi. Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng , vì dung môi để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất để lựa chọn dung môi. Được biết các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi có cả chất phân cực và không phân cực, một số chất tan trong nước, một số ít không tan trong nước mà tan trong các dung môi như methanol [16, 17], ethanol [25] và ethyl acetate [13]. Chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, ngoài yếu tố hoà tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn phải lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm. Do đó, chúng tui chọn nước là dung môi cho quá trình trích ly nấm Linh Chi và sử dụng dung môi
này cho các nghiên cứu tiếp theo.
Dung môi : Methanol 90%; Ethanol 90%; Ethyl acetate 90% - Khối lượng mẫu: 2g
- Thời gian: 90 phút và nhiệt độ: 70oC
- Độ mịn nguyên liệu : Theo mục 3.4.2.1.a
- Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/20
- Trích ly bằng thiết bị Soxhlet
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links