iloveyou.pipapipo
New Member
Download Đề tài Sử dụng kỹ thuật das-Elisa và rt-pcr để phát hiện virus gây bệnh đốm võng trên cây đu đủ tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp
Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân
Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh.
Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.
Nội dung thực hiện:
- Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra.
- Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm
vòng ở hai tỉnh này.
- Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các
mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA.
Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây
4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 %
6 - 8 tháng 85,71 %
8 - 11 tháng 12,50 %
Trên 1năm 36,11 %
Xã Mỹ Hiệp 92,68 %
Xã Bình Thạnh 77,42 %
Xã Phú Tân 47,37 %
Xã Phú Lộc 47,37 %
Xã Phú An 16,00 %
Da bông (Db) 86,54 %
Mã Lai (Ml) 80,00 %
Địa phƣơng (Đp) 34,92 %
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR
- Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn
khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn.
- Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P.
Kết quả giải trình tự một số mẫu
- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
619 bp.
- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
410 bp.
- Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
412 bp.
So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P
trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14-
M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P.
Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng
pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
MỤC LỤC ......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH..............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................... xii
PHẦN I ............................................................................................................................1
GIỚI THIỆU....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích ...............................................................................................................2
1.3. Yêu cầu .................................................................................................................2
1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................2
PHẦN II...........................................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................3
2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) ...........................................................3
2.1.1. Phân loại học ..................................................................................................3
2.1.2. Nguồn gốc, phân bố .......................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm thực vật học....................................................................................4
2.1.4. Nhu cầu sinh thái............................................................................................5
2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ............................................6
2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng ...................................................................................6
2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn..................................................................................7
2.1.6. Tình hình sản xuất..........................................................................................8
2.1.7. Sâu bệnh .........................................................................................................9
2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính ...........................................................10
2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ................................................................10
2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ..........................11
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật................................................11
2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) ........................15
2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV ......................................20
2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng ........................................................20
2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị ........................................................................20
2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử .......................................21
2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học ...............................................................21
2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử.............................................22
2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác ..........................................................................22
2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay.22
2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain
Reaction) ................................................................................................................24
PHẦN III .......................................................................................................................27
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................27
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................27
3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu .........................................................................................27
3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease)
....................................................................................................................................28
3.3.1. công cụ và thiết bị .......................................................................................28
3.3.2. Hóa chất .......................................................................................................29
3.3.3. Quy trình thực hiện ......................................................................................31
3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA .............................................................................31
3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR...........................................................................35
PHẦN IV .......................................................................................................................39
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................................39
4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu .....................................................39
4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA...................................40
4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra........................................................40
4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây.................................................................42
4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây.....................................................................43
4.3. Kết quả thí nghiệm PCR .....................................................................................44
4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu ........................................................................53viii
PHẦN V ........................................................................................................................56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................56
5.1. Kết luận...............................................................................................................56
5.2. Đề nghị................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................58
PHỤ LỤC ......................................................................................................................61
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp: Base pair
cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid
CP gene: Coating protein gene
DAS ELISA: Direct double antibody sandwich
DMSO: Dimethylsulforxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
DNase: Deoxyribonuclease
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
EIA: Enzyme immunoassay
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
EtBt: Ethidium bromide
FDA: Food and Drug Administration
MMLV: Moloney murine leukemia virus
mRNA: Messenger RNA
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
p-NPP: p- nitrophenyl phosphate
PRSV: Papaya ringspot virus
PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction
T
a: Annealing temperature
T
m: Melting temperature
UV: Ultra violetx
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Cây đu đủ ........................................................................................................3
Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus ........................................................................12
Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây ............................................16
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá.................................................................................17
Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) .................................18
Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả ...................................................................18
Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải)...............................................19
Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA ..................................................................................24
Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn ...........................................44
b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 ................................44
Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 ..................................................................45
Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1..............................................................46
Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1...........................................................47
Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên .................................................50
Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 ......................................................51
Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 ........................................................52
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phixi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ ......6
Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) .....................9
Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm ........................................28
Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra..........................................40
Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây..................................................42
Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây.......................................................................43xii
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra ...................................................41
Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây ..................................................................42
Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây .....................................................................43
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
PHẦN I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Tính cấp thiết của đề tài
Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị
kinh tế hiện nay.
Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong
100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit,
năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg),
Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin
A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998).
Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình
sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích
papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hay để diệt khuẩn.
Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng
là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản.
Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV)
(Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không
chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại
rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị
tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986).
Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm
soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách
phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm
vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu
chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác.
Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm
sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối
với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn2
đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất
phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ.
Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong
chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác
nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi
xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát
hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh
Đồng Nai và Đồng Tháp”.
1.2. Mục đích
- Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và
Đồng Tháp.
- Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA.
- Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ.
- Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các
chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới.
1.3. Yêu cầu
- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc.
- Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng.
1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp.
- Phạm vi nghiên cứu
Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA.
Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua
sử dụng kĩ thuật RT-PCR
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
Hình 2.1 Cây đu đủ
(Semillas del Caribe, 2003)
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .)
2.1.1. Phân loại học
- Tên khoa học: Carica papaya L.
- Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ)
Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo
nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc
những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn
nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây
đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây
là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại
trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn
hay làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ
thực phẩm, dƣợc, thuộc da.
Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn
Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya
rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi nhƣ
kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya.
Ở Pháp, trái đu đủ đƣợc gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi đƣợc gọi
theo tên nội địa là figuier des Iles.
Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ đƣợc gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn
cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc
vào từng nƣớc.
Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao.
Ở Châu Âu, khi đƣợc phát hiện lần đầu tiên nó đƣợc đặt cho tên địa phƣơng là “tree
melon” (James A. Duke, 1983).4
2.1.2. Nguồn gốc, phân bố
Mặc dù hiện nay vẫn chƣa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhƣng cây đu đủ
đƣợc đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể
là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998).
Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện
có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và
thƣờng nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng.
Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trƣớc năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu
thập đƣợc là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic. Từ đó việc trồng trọt đã lan
rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam
Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616. Vào khoảng
1550, ngƣời Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt
đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ. Sau đó hạt đu đủ lại đƣợc lan truyền từ Ấn Độ
sang Naples vào năm 1626.
Ở Mỹ, hạt đu đủ đƣợc đem đến Florida từ Bahamas. Đến 1959, đu đủ đƣợc trồng
phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhƣng chủ yếu là trong các vƣờn nhà và
các trang trại với quy mô nhỏ.
Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng nhƣ quần
đảo thuộc Thái Bình Dƣơng và ngày càng trở nên thích hợp đƣợc với nhiều khu vực và
nhiều vùng đất khác nhau.
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Theo những nghiên cứu, khảo sát của James A. Duke trong Handbook of Enery Crop
(1983)
Thân, rễ
Đu đủ là loại thực vật thân thảo, kích thƣớc lớn, sau khoảng một năm cây có thể cao
từ 1,8 - 3 m, sau đó có thể đạt đến độ cao 6 m thậm chí là 9 m. Thân già có màu xám
xanh, nâu xám hay nâu đỏ. Thân cây xù xì, lồi lõm do những vết sẹo của lá rụng, sẹo
phát hoa để lại.
Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi,
phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng. Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thƣơng do
cơ giới cũng nhƣ do ngập úng hay khô hạn. Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy
Nhận xét:
Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tui thấy chỉ xuất
hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của
mồi đặc hiệu hơn, chúng tui tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và
2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band
mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà
không thu đƣợc kết quả nên chúng tui tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và
chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài
liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy
chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của
DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình
tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng
độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu
kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân
Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh.
Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.
Nội dung thực hiện:
- Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra.
- Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm
vòng ở hai tỉnh này.
- Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các
mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA.
Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây
- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây
4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 %
6 - 8 tháng 85,71 %
8 - 11 tháng 12,50 %
Trên 1năm 36,11 %
Xã Mỹ Hiệp 92,68 %
Xã Bình Thạnh 77,42 %
Xã Phú Tân 47,37 %
Xã Phú Lộc 47,37 %
Xã Phú An 16,00 %
Da bông (Db) 86,54 %
Mã Lai (Ml) 80,00 %
Địa phƣơng (Đp) 34,92 %
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR
- Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn
khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn.
- Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P.
Kết quả giải trình tự một số mẫu
- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
619 bp.
- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
410 bp.
- Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc
412 bp.
So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P
trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14-
M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P.
Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng
pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
MỤC LỤC ......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH..............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................... xii
PHẦN I ............................................................................................................................1
GIỚI THIỆU....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích ...............................................................................................................2
1.3. Yêu cầu .................................................................................................................2
1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................2
PHẦN II...........................................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................3
2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) ...........................................................3
2.1.1. Phân loại học ..................................................................................................3
2.1.2. Nguồn gốc, phân bố .......................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm thực vật học....................................................................................4
2.1.4. Nhu cầu sinh thái............................................................................................5
2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ............................................6
2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng ...................................................................................6
2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn..................................................................................7
2.1.6. Tình hình sản xuất..........................................................................................8
2.1.7. Sâu bệnh .........................................................................................................9
2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính ...........................................................10
2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ................................................................10
2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ..........................11
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật................................................11
2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) ........................15
2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV ......................................20
2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng ........................................................20
2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị ........................................................................20
2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử .......................................21
2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học ...............................................................21
2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử.............................................22
2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác ..........................................................................22
2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay.22
2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain
Reaction) ................................................................................................................24
PHẦN III .......................................................................................................................27
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................27
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................27
3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu .........................................................................................27
3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease)
....................................................................................................................................28
3.3.1. công cụ và thiết bị .......................................................................................28
3.3.2. Hóa chất .......................................................................................................29
3.3.3. Quy trình thực hiện ......................................................................................31
3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA .............................................................................31
3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR...........................................................................35
PHẦN IV .......................................................................................................................39
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................................39
4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu .....................................................39
4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA...................................40
4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra........................................................40
4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây.................................................................42
4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây.....................................................................43
4.3. Kết quả thí nghiệm PCR .....................................................................................44
4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu ........................................................................53viii
PHẦN V ........................................................................................................................56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................56
5.1. Kết luận...............................................................................................................56
5.2. Đề nghị................................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................58
PHỤ LỤC ......................................................................................................................61
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp: Base pair
cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid
CP gene: Coating protein gene
DAS ELISA: Direct double antibody sandwich
DMSO: Dimethylsulforxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
DNase: Deoxyribonuclease
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
EIA: Enzyme immunoassay
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
EtBt: Ethidium bromide
FDA: Food and Drug Administration
MMLV: Moloney murine leukemia virus
mRNA: Messenger RNA
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
p-NPP: p- nitrophenyl phosphate
PRSV: Papaya ringspot virus
PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction
T
a: Annealing temperature
T
m: Melting temperature
UV: Ultra violetx
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Cây đu đủ ........................................................................................................3
Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus ........................................................................12
Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây ............................................16
Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá.................................................................................17
Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) .................................18
Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả ...................................................................18
Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải)...............................................19
Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA ..................................................................................24
Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn ...........................................44
b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 ................................44
Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 ..................................................................45
Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1..............................................................46
Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1...........................................................47
Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên .................................................50
Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 ......................................................51
Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 ........................................................52
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phixi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ ......6
Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) .....................9
Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm ........................................28
Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra..........................................40
Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây..................................................42
Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây.......................................................................43xii
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra ...................................................41
Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây ..................................................................42
Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây .....................................................................43
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
PHẦN I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Tính cấp thiết của đề tài
Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị
kinh tế hiện nay.
Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong
100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit,
năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg),
Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin
A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998).
Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình
sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích
papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hay để diệt khuẩn.
Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng
là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản.
Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV)
(Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không
chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại
rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị
tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986).
Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm
soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách
phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm
vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu
chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác.
Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm
sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối
với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn2
đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất
phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ.
Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong
chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác
nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi
xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát
hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh
Đồng Nai và Đồng Tháp”.
1.2. Mục đích
- Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và
Đồng Tháp.
- Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA.
- Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ.
- Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các
chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới.
1.3. Yêu cầu
- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc.
- Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng.
1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp.
- Phạm vi nghiên cứu
Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA.
Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua
sử dụng kĩ thuật RT-PCR
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
Hình 2.1 Cây đu đủ
(Semillas del Caribe, 2003)
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .)
2.1.1. Phân loại học
- Tên khoa học: Carica papaya L.
- Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ)
Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo
nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc
những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn
nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây
đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây
là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại
trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn
hay làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ
thực phẩm, dƣợc, thuộc da.
Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn
Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya
rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi nhƣ
kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya.
Ở Pháp, trái đu đủ đƣợc gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi đƣợc gọi
theo tên nội địa là figuier des Iles.
Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ đƣợc gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn
cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc
vào từng nƣớc.
Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao.
Ở Châu Âu, khi đƣợc phát hiện lần đầu tiên nó đƣợc đặt cho tên địa phƣơng là “tree
melon” (James A. Duke, 1983).4
2.1.2. Nguồn gốc, phân bố
Mặc dù hiện nay vẫn chƣa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhƣng cây đu đủ
đƣợc đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể
là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998).
Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện
có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và
thƣờng nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng.
Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trƣớc năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu
thập đƣợc là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic. Từ đó việc trồng trọt đã lan
rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam
Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616. Vào khoảng
1550, ngƣời Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt
đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ. Sau đó hạt đu đủ lại đƣợc lan truyền từ Ấn Độ
sang Naples vào năm 1626.
Ở Mỹ, hạt đu đủ đƣợc đem đến Florida từ Bahamas. Đến 1959, đu đủ đƣợc trồng
phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhƣng chủ yếu là trong các vƣờn nhà và
các trang trại với quy mô nhỏ.
Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng nhƣ quần
đảo thuộc Thái Bình Dƣơng và ngày càng trở nên thích hợp đƣợc với nhiều khu vực và
nhiều vùng đất khác nhau.
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Theo những nghiên cứu, khảo sát của James A. Duke trong Handbook of Enery Crop
(1983)
Thân, rễ
Đu đủ là loại thực vật thân thảo, kích thƣớc lớn, sau khoảng một năm cây có thể cao
từ 1,8 - 3 m, sau đó có thể đạt đến độ cao 6 m thậm chí là 9 m. Thân già có màu xám
xanh, nâu xám hay nâu đỏ. Thân cây xù xì, lồi lõm do những vết sẹo của lá rụng, sẹo
phát hoa để lại.
Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi,
phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng. Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thƣơng do
cơ giới cũng nhƣ do ngập úng hay khô hạn. Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy
Nhận xét:
Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tui thấy chỉ xuất
hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của
mồi đặc hiệu hơn, chúng tui tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và
2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band
mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà
không thu đƣợc kết quả nên chúng tui tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và
chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài
liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy
chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của
DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình
tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng
độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu
kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: